[发明专利]基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法

摘要

本发明公开了基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，该方法利用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针与转基因物种的靶基因杂交后在DNA连接酶的作用下形成环化单链探针，该探针在恒温条件下被生物素复制引物滚动复制和支链扩增，产生含有多个串连重复片段的生物素化滚环扩增产物，扩增产物与钌标记的DNA探针杂交，再通过链霉亲和素包被的磁珠分离、电化学发光检测，判断转基因的有无。本发明的滚环扩增检测方法中所扩增的基因并不是转基因物种的原基因序列而是探针序列，转基因物种的原基因只是提供了一个探针环化的互补支架，保证了扩增的安全性和特异性；另外所有的扩增过程都可在恒温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。

主权项

1、一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)从转基因物种样品中提取样品的基因组DNA即靶基因1；(2)将靶基因1与过量的靶基因探针2混合，90～95℃变性，然后自然冷却到室温，靶基因1与靶基因探针2退火、杂交；(3)然后加入2～5个单位DNA连接酶，37℃下进行连接反应20～30分钟，靶基因探针2被DNA连接酶连接成环化探针3；(4)在上述环化探针3中加入过量的与环化探针3互补的生物素化的复制引物4、10～15个单位DNA聚合酶和1～3毫摩尔dNTPs，在37℃进行滚环扩增复制反应90分钟，产生生物素化滚环扩增产物5；(5)在室温下，将步骤(4)得到的生物素化滚环扩增产物5与过量的钌标记的核酸探针6杂交30～60分钟，得到杂交产物；(6)将上述杂交产物与链霉亲和素包被的磁珠孵育20～30分钟，然后用磁分离器分离，去掉上清，收集磁珠吸附的杂交产物于电化学发光仪器检测样品池中；(7)往检测样品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，检测样品池中的三联吡啶钌复合物产生的电化学发光信号确定样品中是否含有转基因产品；所述步骤(2)的靶基因探针2是一段线性单链DNA探针，其长度为50～200个碱基长度，每条探针有一个5’磷酸末端和一个3’羟基末端；靶基因探针2包括两个部分，分别为位于5’端和3’端的目标基因杂交区，以及位于5’端和3’端的目标基因杂交区中的填充区，所述杂交区的序列与靶基因1完全互补；所述步骤(4)的生物素化的复制引物4是一段5’端标记上生物素的DNA单链，其长度为15～30个碱基长度，它的序列与环化探针3的填充区互补；所述步骤(5)钌标记的核酸探针6为标记上钌的核酸探针，其长度为15～30个碱基长度，其序列与生物素化滚环扩增产物5的重复序列互补。