[发明专利]采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法

摘要

一种采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法：1.高分子真皮支架制备与修饰，2.从胚胎干细胞和皮肤组织制备表皮干细胞，3.制备原代人成纤维细胞，4.制备全层皮肤专用培养基，5.构建全层皮肤。本全层皮肤利用表皮干细胞分化增殖能力强的特点，构建的皮肤形态、组织结构和功能活性能满足亚慢性毒性检验的需要；人工合成的支架材料标准化程度高、批间差异小；皮肤构建全程采用无血清培养基，减少了影响组织构建的因素，为以后用于毒性试验奠定了基础。通过本发明制备的全层皮肤更接近于天然皮肤，其应用于毒性检验的方式和检测指标更符合实际情况，可以代替整体动物，直接应用于化学品、化妆品、药品等健康相关产品的皮肤毒性试验。

主权项

1、一种采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，依次包括以下的步骤：I、高分子真皮支架的制备与修饰1)PHBV支架制备：(a)将3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物PHBV溶于氯仿中制成浓度为120-130g/L的溶液，然后每升溶液加入930-950g的氯化钠为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；(b)将浓浆液倒入孔径为0.8～1.0cm圆形金属模具中，待氯仿溶剂挥发约70-80％后，从模具中取出成形支架，再置于通风橱内室温48-54小时晾干，25℃-35℃温度下，1000～1300Pa真空范围内干燥2小时～3小时除去残余溶剂；(c)将成形支架浸入去离子水中，每隔6-8小时换水1次，48-52小时内换水6-8次直至将致孔剂滤除干净，室温晾干，25℃-35℃温度下，1000～1300Pa真空范围内干燥24-48小时制成PHBV多孔三维支架；(d)将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡1-2h，用波长254nm、36W的紫外线正反面各照射1.5-2h，无菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，无菌条件下自然晾干；2)制备胶原-甲壳糖-硫酸软骨素-透明质酸修饰液：按质量比例为14～16∶2～4∶1∶1制备原料I型胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A；在36W紫外灯照射下，用0.1％乙酸搅拌溶解I型胶原然后加入甲壳糖，待甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的6-透明质酸和硫酸软骨素A溶液，继续搅拌溶解3小时；使胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A最终浓度分别为7-8mg/ml、1-2mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml；然后在冰浴条件下加入0.5ml 10×DMEM培养液，用1mol/L的NaOH快速调pH至7.2-7.3；3)修饰PHBV支架：将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的PHBV多孔三维支架表面，室温条件下静置20-30min，以此面为真皮面，在PHBV多孔三维支架的另一面，用浓度为0.4％的人源IV型胶原蛋白浸泡20-30min，此面为表皮面；II、制备表皮干细胞采用两种途径获得表皮干细胞(ESC)：1)从胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞先制备羊膜片：无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无菌环境下，按6孔培养板或12孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入无白血病抑制因子LIF的胚胎干细胞培养液，收集羊膜分泌液备用；从商业途径购买人胚胎干细胞hES，传代培养48小时后，以终浓度为0.125％的胰蛋白酶+0.01％EDTA消化液消化后按5×104个细胞/cm2密度接种于铺布有羊膜的6孔或12孔培养板中，用无人LIF的ES细胞培养液培养；每隔1-2天半量换液；经过4天诱导分化培养后，收集粘附在羊膜上皮表面的表皮干细胞ESC；2)从人皮肤原代分离培养制备表皮干细胞将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织，将包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；用质量浓度0.25％的裂解酶Dispases分离表皮和真皮，然后用生理盐水或D-Hanks液清洗3-5次；表皮部分用质量浓度0.25％胰酶+0.02％EDTA按1∶1比例混合，4℃消化2±0.5小时，消化成单细胞悬液，然后接种于铺布有质量浓度为0.4％的IV型胶原包被的培养皿中，置5％CO2、37℃培养箱内快速黏附10-15min后，弃去未粘附细胞；将粘附细胞吹打脱离培养壁，按1×104个/cm2置于第2步1)制备的铺布有人羊膜的培养皿上继续培养，培养基为无LIF的ES完全培养基；或将细胞接种于用5μg/ml丝裂霉素C处理的小鼠3T3成纤维细胞滋养层上继续培养，所用培养基为全层皮肤专用培养基；将上述两种方法之一制备的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19 CK19单克隆抗体和鼠抗人β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳性；III、制备原代人成纤维细胞：取外科环切手术获取的包皮组织，以第2步2)所述方法分离皮肤真皮部分，以0.125％胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后放入含10％新生牛血清高糖DMEM培养基培养，每24-36小时半量换液，培养3～4天，待细胞融合约80％时，县酶消化收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备；IV、全层皮肤专用培养基制备取第2步1)收集的人羊膜分泌液，经0.22μm微孔小组膜过滤后，与角质细胞无血清培养基KSM与按体积比1.5～2∶8～8.5混合，再添加关键促生长因子5×10-10M霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子EGF、5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、30μg/mL庆大霉素、15ng/mL两性霉素、30μg/mL牛垂体提取物、5μg/ml转铁蛋白、1×10-10M甲状腺素T3、24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分，培养基中钙终浓度为0.10mM；V、全层皮肤制备：将第1步所得的PHBV多孔三维支架置于6孔或12孔培养板上，经复合胶原修饰的真皮面向上，以最小容量100-200μl接种以人KSM培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细胞，细胞密度为1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，待4-8小时细胞粘附后，加1.5-2ml足量角质细胞无血清培养基浸没培养，每36-48小时半量换液，培养5-7天，完成全层皮肤真皮部分构建；将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步1)或2)制备的人表皮干细胞，接种细胞密度为1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，用第4步制备的全层皮肤专用培养基代替含10％新生牛血清的H-DMEM培养基，浸没培养72-96小时后，采用气-液界面培养，每48-60小时半量换液，10-14天后完成全层皮肤制备；VI、检测同一批以12孔培养板制备的组织工程皮肷中，取其中一块皮肤固定于以PBS配制的4％多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5μm-6μm，苏木素-伊红H.E染色；显微镜下观察人工皮肤的组织结构：去除皮肤结构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者，即得表皮层含基底层、棘层、颗粒层和角化层等分化结构；真皮层含大量成纤维细胞，与PHBV支架融合性好，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显的组织工程皮肤产品，可用于皮肤毒性检测试验。