[发明专利]替曲卡星A的生物合成基因簇及其应用

摘要

本发明是一种由青褐色小单孢菌(Micromonospora chalcea NRRL11289)产生的具有抗肿瘤活性的抗生素--替曲卡星A(Tectrocarcin A)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含36个基因：5个非重复使用的I型聚酮合成酶基因；4个特殊三碳单元生物合成基因；11个脱氧糖生物合成基因；9个后修饰基因；2个调节基因；1个抗性基因；以及4个功能不确定的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断替曲卡星A的生物合成。本发明所提供的基因及其蛋白也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

主权项

1.一种抗生素——替曲卡星A的生物合成基因簇，其在于编码替曲卡星A生物合成所涉及的36个基因，具体为：1)替曲卡星A非重复使用的I型聚酮合成酶基因，即tcaA1，tcaA2，tcaA3，tcaA4，tcaA5共5个基因：tcaA1位于基因簇核苷酸序列第25588-44580个碱基处，长度为18993个碱基对，编码聚酮合成酶，6330个氨基酸；tcaA2位于基因簇核苷酸序列第44582-65605个碱基处，长度为21024个碱基对，编码聚酮合成酶，7007个氨基酸；tcaA3位于基因簇核苷酸序列第89806-101700个碱基处，长度为11895个碱基对，编码聚酮合成酶，3964个氨基酸；tcaA4位于基因簇核苷酸序列第65565-71087个碱基处，长度为5523个碱基对，编码聚酮合成酶，1840个氨基酸；tcaA5位于基因簇核苷酸序列第71162-75775个碱基处，长度为4614个碱基对，编码聚酮合成酶，1537个氨基酸；2)替曲卡星A特殊三碳单元生物合成基因，即tcaD1，tcaD2，tcaD3，tcaD4共4个基因：tcaD1位于基因簇核苷酸序列第78352-80253个碱基处，长度为1902个碱基对，编码甲氧基-丙二酰基载体蛋白合成酶，633个氨基酸；tcaD2位于基因簇核苷酸序列第80250-80477个碱基处，长度为228个碱基对，编码独立存在的酰基载体蛋白，75个氨基酸；tcaD3位于基因簇核苷酸序列第80474-82324个碱基处，长度为1851个碱基对，N端结构域编码丙酮酸2-氧代戊二酸脱氢酶，C端结构域编码水解酶/乙酰基转移酶，616个氨基酸；tcaD4位于基因簇核苷酸序列第77303-78355个碱基处，长度为1053个碱基对，编码III型聚酮合成酶，350个氨基酸；3)替曲卡星A脱氧糖阿米西糖和毛地黄毒糖以及硝基脱氧糖Tetronitrose的生物合成基因，即tcaB1，tcaB2，tcaB3，tcaB4，tcaB5，tcaB6，tcaB7，tcaB8，tcaB9，tcaB10，tcaB11共11个基因：tcaB1位于基因簇核苷酸序列第19343-20230个碱基处，长度为888个碱基对，编码dNDP-D-葡萄糖合成酶，295个氨基酸；tcaB2位于基因簇核苷酸序列第20227-21225个碱基处，长度为999个碱基对，编码dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶，332个氨基酸；tcaB3位于基因簇核苷酸序列第89533-88076个碱基处，长度为1464个碱基对，编码2，3-脱水酶，487个氨基酸；tcaB4位于基因簇核苷酸序列第13499-14497个碱基处，长度为999个碱基对，编码3-酮基还原酶，332个氨基酸；tcaB5位于基因簇核苷酸序列第12849-13442个碱基处，长度为603个碱基对，编码NDP-己糖-5-异构酶，200个氨基酸；tcaB6位于基因簇核苷酸序列第102587-101715个碱基处，长度为873个碱基对，编码氧化还原酶，290个氨基酸；tcaB7位于基因簇核苷酸序列第16895-18037个碱基处，长度为1143个碱基对，编码氨基转移酶，380个氨基酸；tcaB8位于基因簇核苷酸序列第22600-23721个碱基处，长度为1122个碱基对，编码氨基转移酶，373个氨基酸；tcaB9位于基因簇核苷酸序列第23743-24987个碱基处，长度为1245个碱基对，编码甲基转移酶，414个氨基酸；tcaB10位于基因簇核苷酸序列第21290-22594个碱基处，长度为1305个碱基对，编码酰基辅酶A脱氢酶，434个氨基酸；tcaB11位于基因簇核苷酸序列第16681-15890个碱基处，长度为792个碱基对，编码甲基转移酶，263个氨基酸；4)替曲卡星A大环骨架的后修饰基因，即tcaC，tcaE1，tcaE2，tcaF，tcaM，tcaT1，tcaT2，tcaT3，tcaT4，共9个基因：tcaC位于基因簇核苷酸序列第9250-9810个碱基处，长度为561个碱基对，编码黄素依赖的氧化酶，186个氨基酸；tcaE1位于基因簇核苷酸序列第75796-77271个碱基处，长度为1476个碱基对，编码FAD依赖的氧化酶，491个氨基酸；tcaE2位于基因簇核苷酸序列第87242-85225个碱基处，长度为1518个碱基对，编码FAD-脱氢酶，505个氨基酸；tcaF位于基因簇核苷酸序列第88026-87268个碱基处，长度为765个碱基对，编码硫酯酶，254个氨基酸；tcaM位于基因簇核苷酸序列第18152-19294个碱基处，长度为1143个碱基对，编码O-酰基转移酶，380个氨基酸；tcaT1位于基因簇核苷酸序列第8022-9134个碱基处，长度为1113个碱基对，编码糖基转移酶，370个氨基酸；tcaT2位于基因簇核苷酸序列第15731-14553个碱基处，长度为1179个碱基对，编码糖基转移酶，392个氨基酸；tcaT3位于基因簇核苷酸序列第83216-84410个碱基处，长度为1197个碱基对，编码糖基转移酶，398个氨基酸；tcaT4位于基因簇核苷酸序列第84455-85594个碱基处，长度为1140个碱基对，编码糖基转移酶，379个氨基酸；5)替曲卡星A的调节基因，即tcaR1，tcaR2共2个基因：tcaR1位于基因簇核苷酸序列第11988-12791个碱基处，长度为804个碱基对，编码特异活化因子，267个氨基酸；tcaR2位于基因簇核苷酸序列第83045-82467个碱基处，长度为579个碱基对，编码TetR家族转录调节因子，192个氨基酸；6)替曲卡星A的抗性基因，即tcaG共1个基因：tcaG位于基因簇核苷酸序列第104125-102653个碱基处，长度为1473个碱基对，编码药物排出蛋白，490个氨基酸；7)还包括4个功能不明确的基因，即tcaU1，tcaU2，tcaU3，tcaU4：tcaU1位于基因簇核苷酸序列第10171-9842个碱基处，长度为330个碱基对，编码未知功能蛋白，109个氨基酸；tcaU2位于基因簇核苷酸序列第10440-10880个碱基处，长度为441个碱基对，编码未知功能蛋白，146个氨基酸；tcaU3位于基因簇核苷酸序列第10691-11629个碱基处，长度为939个碱基对，编码未知功能蛋白，312个氨基酸；tcaU4位于基因簇核苷酸序列第25068-25562个碱基处，长度为495个碱基对，编码未知功能蛋白，164个氨基酸。