[发明专利]测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法

摘要

本发明公开了测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是合成盐酸克伦特罗的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原。通过免疫动物获得四种兔抗盐酸克伦特罗的多克隆抗体。四种抗体均可用于盐酸克伦特罗的免疫分析，标准曲线的浓度范围为0.01～100ng/mL，IC₅₀为0.1～0.9ng/mL，其中，灵敏度最高的ELISA的IC₅₀为0.1～0.3ng/mL，较市售的ELISA试剂盒的灵敏度提高了5～50倍；四种抗体与沙丁胺醇的交叉反应率为25.37～45.83％，与其他9种可添加于动物饲料中的药物几乎没有交叉反应，说明所建立的ELISA特异性强。

主权项

1.测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)盐酸克伦特罗修饰物的制备将1～5mg盐酸克伦特罗溶解于0.2～0.6mL水中，缓慢滴加0.1～0.3mL浓度为10～16.7mg/mL的NaNO₂溶液，用盐酸调节混合液的pH值至1.5，暗处4℃反应过夜；取少量上述溶液，滴加到N，N-二甲基苯胺中，溶液颜色由无色变为淡黄色，表明重氮化反应完成；5～11mg氨基磺酸胺溶解于0.1～0.2mL水中，缓慢滴加到重氮盐溶液中，终止反应；(2)免疫原及包被抗原的制备称取牛血清白蛋白50～100mg和卵清蛋白30～60mg，分别溶解于5mL浓度为0.01mol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液中；将重氮化溶液缓慢滴加至蛋白质溶液中，加入少量NaOH溶液，使混合液的pH值保持在7.5，搅拌下4℃反应4小时；将混合物装入透析袋中，透析数天，获得两种盐酸克伦特罗-蛋白质溶液，冷冻干燥，-20℃保存待用；盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白和盐酸克伦特罗-卵清蛋白分别用作免疫原及包被抗原；(3)盐酸克伦特罗多克隆抗体的制备两种免疫原分别免疫两只兔子：将1～4mg免疫原溶解于0.5～4mL的生理盐水中，加入0.5～3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.5～2.0mL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，1～5周后，对兔进行加强免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周进行下一次免疫，并且第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，5～15天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于低温冰箱中储存，有四种抗体，即盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白制备的抗体I，II和盐酸克伦特罗-卵清蛋白制备的抗体III，IV；(4)建立测定盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定盐酸克伦特罗含量的ELISA；(5)ELISA对加标样品中盐酸克伦特罗含量的测定选择了5种阴性样品：牛奶I，牛奶II，猪肝I、鸡肝I和动物饲料I进行加标实验，取1～5g样品，加入1～5μL的盐酸克伦特罗储备液，(1)牛奶样品：量取1～5mL牛奶样品于离心管中，加入纯水稀释1倍，漩涡仪漩涡5分钟，加入浓度为0.1mol/L盐酸1～5mL，水浴振荡器振荡半小时，静置过夜，次日超声萃取15分钟，50℃水浴加热，离心，取上层清液待测；(2)肝脏样品：市场购买的肝脏水洗去血，晾干，取适量肝脏样品切碎，匀浆5分钟，称取1～5g浆状样品，加入浓度为0.1mol/L稀盐酸1～5mL，水浴振荡器振荡半小时，静置过夜，次日超声萃取15分钟，离心，取上层清液待测；(3)饲料样品：取饲料样品，研磨成细粉，称1～5g样品，加入浓度为0.1mol/L稀盐酸1～5mL，水浴振荡器振荡半小时，次日超声萃取15分钟，离心，取上层清液待测；加标样品萃取液按1:400～1:1000稀释后用ELISA直接测定，盐酸克伦特罗的加标回收率为92.2～97.0％，相对标准偏差为1.3～5.3％，说明方法准确性和精密度都比较好；(6)ELISA和HPLC的比较盐酸克伦特罗的HPLC条件为：色谱条件：Hypersil Gold柱，柱温为室温，流动相为甲醇：0.01mol/L NaH₂PO₄水溶液＝35:65，流量1mL/min，进样20μL，紫外检测波长：240nm，盐酸克伦特罗标准溶液的浓度分别为：0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20μg/mL，样品萃取液用0.45μm的滤膜过滤后直接测定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证，5种加标样品，即牛奶I，加标浓度1μg/mL；牛奶II，加标浓度2μg/mL；猪肝I，加标浓度4μg/g；鸡肝I，加标浓度5μg/g；动物饲料I，加标浓度3μg/g；加标样品用浓度为0.1mol/L盐酸萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵坐标作图得两者的相关曲线，回归方程为Y＝0.992X+0.469，相关系数为0.989，n＝5，说明二者的相关性很好。