[发明专利]从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺

摘要

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺。将Exendin-4高产工程菌株经细菌培养、非变性亲和层析、用肠激酶去除N端融合肽步骤得到纯化的Exendin-4。和现有技术相比，本发明对裂解液和洗脱液的配方作出了改进，采用梯度洗脱工艺，从而增加了目的蛋白的产量和纯度，另外本发明简化了操作程序，操作步骤简便易行，适合工业化大批生产。

主权项

1.一种从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺，其特征在于它是按下述步骤进行的：(1)一个单克隆接种量200ml AMP-LB培养基，25℃过夜静置培养12h；然后在37℃，220rpm条件下培养至菌液OD600达到0.6后，置于冰上冷却，加入IPTG至浓度为1mM，在30℃、220rpm条件下诱导6h，收获菌液于-20℃保存备用；(2)将步骤(1)保存的菌液于冰上融化后，每克细菌用10ml裂解液悬浮沉淀，冰浴30min，超声波破碎；所用裂解液的组成为：50mM NaH2PO4、500mM NaCl、10mM咪唑、0.01％Trition 100、2％甘油、10mMβ-巯基乙醇、0.1％PMSF、1mM MgCl2、1U RNase、1U DNase；(3)将上述裂解液于4℃，8000rpm离心30min；取上清液与Ni-树脂按2∶1混合，4℃缓慢振荡吸附3h；4℃，3000rpm离心5min，弃去上清；(4)向步骤(3)的树脂中加入细菌裂解液4倍体积的漂洗缓冲液，4℃缓慢振荡30min；4℃，3000rpm离心5min，弃上清；用1倍细菌裂解液体积的漂洗缓冲液重悬浮树脂，转移到层析柱中；收集漂洗缓冲液最后1.5ml，用于鉴定洗液中是否还有杂蛋白；漂洗缓冲液组成为：50mM NaH2PO4；500mMNaCl；20mM咪唑；pH 8.0；(5)先用洗脱液I以1.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液I；再用洗脱液II以1.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液II得到纯化融合蛋白；所用洗脱液I的组成为：50mM NaH2PO4、500mM NaCl、40mM咪唑、2％甘油、10mMβ-巯基乙醇，；所用洗脱液II的组成为：50mM NaH2PO4、500mM NaCl、80mM咪唑、2％甘油、10mMβ-巯基乙醇；(6)每3mg重组Exendin-4加入1U肠激酶，4℃消化6h，将酶消化液与Ni-树脂混合后吸附3h后，过层析柱得到的洗脱液即纯化的Exendin-4溶液。