[发明专利]诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法及专用培养基

摘要

本发明公开了一种体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法及其专用培养基。该体外诱导方法包括以下步骤：1)将人胚胎干细胞用分化培养基I悬浮，再将细胞悬液移入低吸附性细菌培养皿中，在37℃、5％CO₂下培养1-3天形成拟胚体后，再将拟胚体用分化培养基II在相同条件下培养2-4天后分化为定型内胚层细胞；2)将步骤1)分化的定型内胚层细胞接种到表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞饲养层上，加入分化培养基III，在37℃、5％CO₂下共培养4-6天后，再更换为分化培养基IV，在相同条件下继续培养5-20天，得到肝细胞。本发明具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点，将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

主权项

1、用于体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的培养基，包括依次使用的以下四种培养基：其中，分化培养基I即拟胚体分化培养基：是在DF-12培养基的基础上添加了15-25％血清替代物，0.05-0.15mM β-巯基乙醇和0.5-1.5mM谷氨酰胺，pH7.2-7.6；分化培养基II即定型内胚层分化培养基：是在DF-12培养基的基础上添加了0.5-1.5％胎牛血清，0.05-0.15mM β-巯基乙醇，0.5-1.5mM谷氨酰胺，和100ng/mL活化素A，pH7.2-7.6；分化培养基III即肝细胞诱导条件培养基：是按体积比1-4∶4-1比例混合的FLSC条件培养液与HepatoZYME-SFM，pH7.2-7.6，所述FLSC条件培养液的配方为：每100mL培养基含HDMEM培养基45mL，DF-12培养基45mL，胎牛血清10mL；分化培养基IV即肝细胞诱导分化培养基：是在分化培养基III的基础上添加了15-25ng/mL肝细胞生长因子HGF，5-15ng/mL制瘤素OSM和10-6-10-8M地塞米松DEX，pH7.2-7.6。