[发明专利]一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法

摘要

一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了目前经代谢工程改造后的酿酒酵母木糖利用率仍然很低，且发酵副产物木糖醇产生量高的问题。构建方法：先克隆KanR基因、XKS1基因、ADH1终止子片段、酿酒酵母中2.2kb rDNA片段；然后回收、纯化基因片段与pGEMT Easy载体连接；再依次构建质粒pR、质粒pRK和质粒pRKT；最后将2.2kb rDNA片段加入质粒pRKT。本发明方法所构建的载体可以将XKS1基因高拷贝整合到酿酒酵母的染色体基因组上，实现XKS1的超量稳定表达，疏通了酿酒酵母利用木糖产乙醇的木糖代谢流，提高了木糖的利用率，降低了副产物木糖醇的产量。

主权项

1、一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、克隆质粒pKT0150中KanR基因；二、克隆酿酒酵母XKS1基因；三、克隆质粒pKT0150中ADH1终止子片段；四、克隆酿酒酵母中2.2kb rDNA片段；五、回收、纯化步骤一至四制备的基因片段，然后再分别与pGEMT Easy载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-KanR、pGMT-XKS1、pGMT-ADH1T和pGMT-rDNA；六、构建质粒pR，以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架引入有抗性标记的基因KanR；七、构建质粒pRK，将XKS1基因加入质粒pR；八、构建质粒pRKT，将ADH1终止子片段加入质粒pRK；九、将2.2kb rDNA片段加入质粒pRKT，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列为5’-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步骤二中扩增上游引物序列为5’-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3’，下游引物序列为5’-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3’；步骤三中扩增上游引物序列为5’-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3’，下游引物序列为5’-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3’；步骤四中扩增上游引物序列为5’-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3’，下游引物序列为5’-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。