[发明专利]检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法及其试剂盒

摘要

本发明提供一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法及其试剂盒，步骤如下：1)制备免疫渗滤试纸条；2)禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上的固定化；3)制备禽流感病毒金标单克隆抗体金标探针；4)制备增敏试剂；5)检测禽流感病毒。本发明利用氯金酸与抗坏血酸发生氧化还原反应生成金原子可被胶体金吸附的特点，来定位胶体金沉积部位进行显色加强，提高了待检抗原的检测灵敏度8～50倍。本发明是在胶体金斑点免疫渗滤测定法(双抗体夹心)的基础上，采用纳米金颗粒增敏技术，能提高检测禽流感病毒的检测灵敏度，能进行样品的高通量筛查，适用于基层或现场检测禽流感病毒。

主权项

1. 一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法，步骤如下：1)制备免疫渗滤试纸条免疫渗滤试纸条为A或B之一；制备免疫渗滤试纸条A：沿长为40-110mm、宽为3-6mm的矩形聚乙烯塑料基片长的方向设有孔间距为2—4mm的8—15个呈一行分布的直径为0.5-3mm的圆形进样孔；将与聚乙烯塑料基片大小相同的硝酸纤维素膜片粘附于其下面；加样时带有进样孔的聚乙烯塑料基片在上；制备免疫渗滤试纸条B：切制8-15个直径0.5-3mm的圆形硝酸纤维素膜片粘附于长为40-110mm、宽为3-6mm的矩形聚乙烯.塑料基片，膜片间距为3—4mm；每个膜片下方的塑料基片上设有两个吸水孔，吸水孔是将与膜片圆心重叠、与塑料基片长平行的长轴比膜片圆的直径长0.3mm、与塑料基片宽平行的短轴比膜片圆的直径短0.2mm的椭圆未被膜片覆盖的部分去除得到的孔，加样时带吸水孔的塑料聚乙烯基片在下面；2)禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上的固定化(1)制备固定化禽流感病毒多克隆抗体的免疫渗滤试纸条a. 制备禽流感病毒多克隆抗体溶液用磷酸盐缓冲液PBS稀释禽流感病毒多克隆抗体，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为0.05-0.3mg/mL，制得禽流感病毒多克隆抗体溶液；b. 禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上的固定化禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上固定化采用点样固定化法或浸泡固定化法之一；点样固定化法：向上述免疫渗滤试纸条A的每个进样孔或免疫渗滤试纸条B的每个膜片上点1-3μL上述禽流感病毒多克隆抗体溶液；点样可为1次—3次，待渗，风干；得到固定化试纸条A或B；或浸泡固定化法：取500-1000μL上述禽流感病毒多克隆抗体溶液置于小试管中，4℃浸泡5—10条免疫渗滤试纸条A或B10—15小时，取出，风干；得到固定化试纸条A或B；(2)试纸条的封闭将上述用点样法或浸泡法得到的固定化试纸条A或B，放入用双蒸水稀释的重量百分比浓度为1-5％的牛血清白蛋白溶液中，37℃封闭20-60min；取出，风干，得到待用固定化试纸条；4℃保存，备用；3)制备禽流感病毒金标单克隆抗体探针(1)制备胶体金溶液a. 制备胶体金溶液的试剂及其体积配比：双蒸水 100mL、新鲜制备的重量百分比浓度为1％的氯金酸水溶液 1mL、重量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液 1.0-1.5mL；b. 制备胶体金溶液将所需的双蒸水加热煮沸；加入所需的新鲜制备的重量百分比浓度为1％的氯金酸水溶液，迅速加入所需的重量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，不断搅拌，得到酒红色的胶体金溶液；(2)胶体金标记禽流感病毒单克隆抗体a. 制备禽流感病毒单克隆抗体用禽流感病毒免疫小鼠制备获得能够分泌禽流感单克隆抗体的杂交瘤细胞株，获得通用A型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒或H9亚型禽流感病毒的特异性单克隆抗体之一；b. 制备胶体金标记禽流感病毒单克隆抗体取上述制备的胶体金溶液10mL，用重量百分比浓度为1％的碳酸钾水溶液调节pH至8.5—9.2；用磷酸盐缓冲液PB将上述制备获得的禽流感病毒单克隆抗体稀释至蛋白含量为0.1—1mg/mL、pH与上述调节后的胶体金溶液的pH值相同，各取0.1-0.5mL，分别在13000rpm、4℃下离心1小时，得到上清液；快速搅拌下将上清液逐滴加入到上述调节过pH值的胶体金溶液中，至液体的最小蛋白量为10—20μg/mL，室温放置5min；再分别加入过滤后的重量百分比浓度为10％BSA溶液1ml，继续搅拌10-15分钟，然后在13000rpm、4℃离心1小时，小心弃去上清液，得到沉淀物；用10ml、浓度为0.01mol/L、pH8.2且其中BSA的重量百分比浓度为1％的三羟甲基氨基甲烷溶液将上述各沉淀物溶解，再在1000rpm/min、4℃离心下10分钟，去除聚集物，留上清液，弃去底部的沉淀，将上清液13000rpm、4℃离心1小时；用5mL含有重量百分比浓度分别为0.02％的叠氮钠、1％的蔗糖、1％的BSA且pH为8.2的三羟甲基氨基甲烷溶液重新悬浮底部疏松沉淀，得到禽流感金标单克隆抗体探针；置于4℃冰箱保存备用；4)制备增敏试剂增敏试剂为试剂A和试剂B；配制试剂A：配制重量百分比浓度为1％—10％的氯金酸水溶液；配制试剂B：配制重量百分比浓度大于0.1-0.5％的抗坏血酸水溶液；5)检测禽流感病毒(1)向上述制备的待用固定化试纸条A的进样孔或B的膜片上分别滴加用PBS稀释成溶液中抗原重量百分比浓度为0.05-0.1mg/mL的通用A型、H5、H7或H9型禽流病毒抗原之一作为需要检测的阳性对照、用洗脱离心稀释常规方法前处理后溶于PBS缓冲溶液的待测样本、针对所要检测的阳性对照抗原通过鸡胚获得的未经病毒感染的尿囊液的阴性对照，各滴加1—3μL，待渗，在室温下反应1分钟以上；得到带阳性对照抗原、待测样本及阴性对照的试纸条；(2)取与上述已选定的需要检测的阳性对照抗原相对应的金标单克隆抗体探针溶液，每份取1—3μL，滴加于上述带阳性对照抗原、待测样本及阴性对照的试纸条A的每个已加过样品的进样孔或B的每个膜片上；室温反应0.5～2分钟，再分别加入含体积百分比浓度为0.02％的吐温20的磷酸盐洗液PBST，洗2-5次，每次三滴，每滴2—10μL，得到待检测试纸条；(3)分别向上述待检测试纸条A已加过金标单克隆抗体探针的每个进样孔或试纸条B的每个膜片上先滴加1-3μL上述增敏试剂的试剂A，然后再滴加3—8μL增敏试剂的试剂B，待风干后，再重复述操作1至2次；最后一次滴加后1—2分钟观察结果，肉眼观察若有灰黑色斑点，则认为该位置对应的禽流感病毒为阳性结果，与阴性对照显色结果无明显区别，则认为该位置对应的禽流感病毒为阴性结果。