[发明专利]从牛奶中提取总DNA的方法

摘要

本发明属于奶牛分子生物学技术研究领域，具体涉及奶牛总DNA制备技术领域。公开了一种从牛奶中提取总DNA的方法。针对奶牛属于经济性动物，为了避免因采血和采取活体奶牛组织而引起的应激，克服提取奶样总DNA含有较高的蛋白质污染障碍等问题，提出了更方便的获取DNA来源，研制出从纯化奶样体细胞到提取高质量DNA的关键技术，通过实验制备出纯化奶样体细胞的试剂和提取DNA的裂解混合液，之后先用不同酒精浓度梯度洗涤，再用酚法抽提去除蛋白质和多糖等其他物质，最后用无水乙醇洗涤，晾干后溶于TE。本发明采样简单方便，抽提的总DNA样品质量较高；本方法经济、稳定、方便，为奶牛的分子生物学的应用提供了新的方法。

主权项

1、一种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤：1)采样前准备：用碘酒擦洗奶牛乳头，用干净温水布擦干乳头上的碘酒，放弃挤出的前2-3把奶，之后用挤奶器或者人工挤奶方法获取奶样；2)采样：预先在离心管中加入1ml体细胞固定液和20％重铬酸钾0.5ml作为防腐剂，将采取的奶样装入离心管至50ml，于2500转/分，4℃离心30分钟；3)弃去步骤2)离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加1ml灭菌磷酸缓冲液，将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5ml的离心管中，在3500转/分，常温下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀；4)向步骤3)的离心管中加入灭菌的磷酸缓冲液1ml，悬浮沉淀，用振荡器振荡直到沉淀完全悬浮为止，然后在1000转/分，常温下离心10分钟；5)离心后将上清弃去，加乳化剂150μl，再加灭菌的磷酸缓冲液1350μl，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，40℃恒温水浴处理5-10分钟脱去体细胞周围的乳脂；6)水浴后，在3500转/分，常温下离心10分钟，离心后弃上清，加磷酸缓冲液1ml悬浮沉淀，将混合液转移至1.5ml的离心管中，于12000转/分离心10分钟使体细胞沉淀，将得到的体细胞置-20℃冻存，或者直接将所述的体细胞进行DNA提取；7)向步骤6)存有体细胞的1.5ml离心管中加入裂解混合液I 600μl和裂解混合液II 150μl，振荡使其底部沉淀至完全悬浮，置于56℃水浴锅过夜消化，得到消化产物；8)对步骤7)的消化产物加入等体积的无水乙醇，12000转/分离心沉淀，弃掉上面的乙醇，然后分别加1ml的95％、75％、70％乙醇进行梯度洗涤，分别弃去上层的乙醇，在常温下蒸发乙醇5分钟，得到DNA粗品；9)将步骤8)得到的DNA粗品加500μl去离子灭菌水使其溶解沉淀，再加两倍体积的pH为8.0的Tris饱和酚溶液进行抽提，来回颠倒10分钟，12000转/分，常温下离心10分钟，得到上清液；10)将步骤9)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，来回颠倒10分钟，按体积比为25∶24∶1加入两倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇，在12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；11)将步骤10)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，按体积比为24∶1加入两倍体积氯仿∶异戊醇，来回颠倒10分钟，12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；12)将步骤11)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M/L，pH为5.2的NaAc和2倍体积的预冷过的无水乙醇，来回摇晃离心管，于-20℃放置30分钟；再于12000转/分，25℃下离心10分钟，小心倒掉上层无水乙醇，得到DNA白色沉淀；13)加入70％的乙醇1ml，洗涤步骤12)所述的DNA白色沉淀，于常温下12000转/分离心10分钟，小心弃去乙醇，在常温下挥发残留乙醇，加入的50-100μl三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸过夜溶解DNA，得到DNA纯品；其中，步骤2)所述的体细胞固定液配制如下：将35-40％甲醛9.4ml定溶于100ml蒸馏水中；步骤5)所述的乳化剂配制如下：在1L乳化剂中：90％的聚乙二醇辛基苯基醚(triton-x 100)20ml，95％乙醇125ml，0.9g/l NaCl溶液855ml；步骤7)所述的裂解混合液I配制如下：混合液I：NaCl 1M/L，Tris-Cl 0.5M/L，EDTA-Na 0.5M/L，调pH至7.5-8.0；步骤7)所述的裂解混合液II配制如下：20％十二烷基硫酸钠40μl，20mg/ml的蛋白酶K 20μl，乳化剂90μl；步骤13)所述的Tris-EDTA溶液配制如下：分别取pH为8.0的1M/L Tris-Cl 2ml和0.5M/L EDTA 0.4ml，将其两种溶液混合均匀，加蒸馏水定容至200ml，调pH至8.0。步骤3)、4)、5)和6)所述的磷酸缓冲液配制如下：分别称取NaCl 8g，KCL 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，将各种物质溶解于800ml蒸馏水中，调pH至7.4，加蒸馏水定容至1L。