[发明专利]基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌流培养方法

摘要

本发明提供一种基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌流培养方法，采用注射器低速抽取接种方法，具体通过低流速的灌流培养和高流速的灌流培养的前后分阶段实施不同灌流速度的调节方法，提高种子细胞在PLGA支架内的接种效率。本发明不但增加了细胞在PLGA支架内的粘附和均匀分布，并且有效地提高了种子细胞在PLGA支架内的增殖效率；通过流液对种子细胞产生的剪切力，增加了种子细胞向成骨细胞定向分化的能力；本发明方法设计合理，达到了种子细胞在PLGA支架内增殖和成骨细胞定向分化的双重目的。

主权项

1. 一种基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌流培养方法，其特征在于通过以下步骤实现：I. 构建灌流培养装置：通过硅胶软管(5)连接蠕动泵(1)、气体过滤装置(2)、贮液瓶(3)和样品槽(4)构建灌流培养装置，贮液瓶(3)的出口端通过硅胶软管(5)与样品槽上槽架(6)进口端相连，贮液瓶(3)进口端通过硅胶软管(5)与样品槽下槽架(7)出口端相连，贮液瓶(3)瓶设有用于进行气体交换的过滤装置(2)，样品槽(4)设有通过螺纹(12)卸接的上槽架(6)和下槽架(7)，上槽架(6)顶部开有培养液进口，下槽架(7)底部开有培养液出口，下槽架(7)内底部垫有微孔网(9)，支架(8)置于样品槽(4)内，位于微孔网(9)上方，垫圈(10)位于样品槽内腔(11)顶部；II. 支架-细胞复合物制备：1)收集培养至第三代的人原代骨髓间充质干细胞：用含10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养液调节细胞密度至2×106个/ml，以制备细胞悬液，备用；2)取经24小时75％酒精消毒的支架，吹干，将吹干的支架放入样品槽下槽架中，用硅胶软管连接样品槽下槽架的下端出口和无菌注射器，吸取上述约250μl的细胞悬液，均匀滴至支架上表面，然后以0.05ml/min的流速轻轻抽取注射器使悬液均匀进入支架内部进行种子细胞接种；3)接种完毕取出支架放于细胞培养板六孔板中静置2小时，然后每孔加5ml含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的α-MEM培养液，静态培养24小时，获得细胞/支架复合物；III. 低流速灌流培养：取上述静态培养24小时后获得的支架-细胞复合物，移入样品槽下槽架内，然后上、下槽架旋转衔接密封样品槽，贮液瓶中加入50ml含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的α-MEM培养液，设定流速0.2ml/min进行灌流培养11天，每隔三天半量换液；IV. 高流速灌流培养：上述灌流培养11天后，增加灌流流速至3.0ml/min进行灌流培养21天，每隔三天半量换液。