[发明专利]一种棉花花粉发育过程中细胞DNA的荧光标记方法

摘要

本发明公开了一种检测棉花花粉母细胞DNA物质的荧光标记方法，属于生物技术领域。包括晴天早晨摘取花蕾，样品经不同浓度乙醇逐级下行至蒸馏水；直径小于7mm的花蕾中的花粉母细胞，置于甘油中渗透2-3h；洗涤后用DAPI避光染色1-2h，细胞内DNA物质被标记。直径大于7mm的花蕾中的成熟花粉粒，加入10％次氯酸钠水溶液于60℃水浴中处理10min；洗涤后置于0.1-0.2％甘油中渗透2-3h；洗涤后再加入DAPI溶液，静置10min后镜检，细胞内DNA物质被标记。本发明具有操作简单、快速，对细胞的损伤小，标记效果好，易观察的优点，将在棉花雄配子体发育过程的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。

主权项

1、一种棉花花粉发育过程中细胞DNA的荧光标记方法，包括以下步骤：1)晴天早晨6—7点间摘取棉花花蕾，剥去苞叶，固定于无水乙醇：冰醋酸配成体积比3∶1的卡诺氏固定液，12—24h后转入体积比为70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；2)固定好的样品经体积浓度为50％、30％、10％的乙醇逐级下行至蒸馏水；3)直径小于7mm的花蕾，用解剖针剥离出其中的花粉母细胞，置于体积比0.1—0.2％的甘油中渗透2-3h；用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉母细胞，将花粉母细胞用0.5-1μg/ml的DAPI避光染色1-2h，细胞内DNA物质被荧光标记；4)直径大于7mm的花蕾，用镊子剥离出其中的成熟花粉粒，加入质量体积比10％的次氯酸钠水溶液，室温振荡放置10min，再于60℃水浴处理10min用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉粒；花粉粒置于体积比0.1—0.2％的甘油中渗透2-3h；用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉粒；再将花粉粒移至载玻片，加入100-200μL浓度为2μg/ml的DAPI溶液，盖片，用力斜压至外壁脱掉而花粉粒细胞不破裂为度，放在暗盒中静置10min后镜检，细胞内DNA物质被荧光标记。