[发明专利]在真核生物中精确替换靶DNA的方法和手段

摘要

本发明提供了在真核细胞如植物细胞中通过同源重组将靶DNA序列精确交换为目的DNA序列的方法和手段，由此采用去除侧接同向重复的两核苷酸序列的选择DNA的方法，能够随后去除可选择或可筛选标记而不不留足迹，该可选择或可筛选标记在同源重组阶段为临时选择基因替换事件而使用。

主权项

1.在真核细胞或真核生物的基因组中将靶DNA序列交换为目的DNA序列的方法，其包括如下步骤：a.在所述真核生物细胞基因组中的预选位点诱导第一双链DNA断裂，所述预选位点位于所述靶DNA序列内部或所述靶DNA序列附近，且所述预选位点被第一双链断裂诱导(DSBI)酶识别；b.向所述真核细胞中引入修复DNA分子，所述修复DNA分子包含：i.位于两侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，所述侧翼DNA区域与侧接所述靶DNA序列的DNA区域，优选与侧接所述真核细胞基因组中所述预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源性；ii.位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因，所述可选择或可筛选标记基因还位于由所述预选位点5’端部分组成的第一重复序列和由所述预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其中所述第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和iii.位于所述一个侧翼DNA区域与所述第一第二重复序列之间的第二DSBI酶的至少一个识别位点；c.选择含有所述可选择或可筛选标记的细胞群；d.选择已经通过所述侧翼DNA区域的同源重组引入了所述可选择或可筛选标记的细胞；e.在所述细胞中所述第二DSBI酶的识别位点处引入双链断裂；f.选择通过所述同向重复之间的同源重组缺失了所述可选择或可筛选标记基因，由此重建了所述预选位点的子代细胞。