[发明专利]靶RNA的检测、定量方法和试剂盒

摘要

提供在对一种或多种病原微生物进行检测、定量等情况下，可以从试样中微量的RNA中简便且迅速地检测、定量靶RNA的方法或试剂盒。1)使用具有启动子序列的液相引物和逆转录酶，由含有靶RNA的试样合成cDNA，得到cDNA-RNA复合体；2)分解该复合体的RNA；3)通过上述2)得到的cDNA和上述固相引物，合成双链DNA；4)由该双链DNA合成RNA；5)通过上述4)得到的RNA和上述固相引物合成cDNA，得到cDNA-RNA复合体；6)分解上述5)得到的复合体的RNA；7)通过上述6)得到的cDNA和上述液相引物，合成双链DNA；8)对上述3)和7)得到的双链DNA进行定量。该方法可以在同一反应液中进行。

主权项

靶RNA的检测、定量方法，其特征在于包括以下的(a)～(j)的工序：(a)将含有与靶RNA的5’端靶特异性序列相对应的DNA序列的引物的5’末端固定在基板表面，制备固相DNA(+)引物的工序；(b)在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列，制备液相cDNA(-)引物的工序；(b’)根据需要，制备在标签序列的5’末端附加RNA聚合酶启动子序列的液相通用引物的工序；(c)制备含有靶RNA的3’端序列和5’端靶特异性序列的试样RNA的工序；(d)使工序(b)中制备的液相cDNA(-)引物与工序(c)中制备的试样RNA链在液相中接触，使液相cDNA(-)引物与试样RNA杂交，然后通过逆转录酶使DNA(-)链延长，制备cDNA链-RNA链复合体的工序；(e)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(d)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备单链DNA(-)的工序；(f)使工序(e)中制备的单链DNA(-)与工序(a)中制备的固相DNA(+)引物在液相中接触，使单链DNA(-)与固相DNA(+)引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA(+)链延长制备双链DNA的工序；(g)使RNA聚合酶作用于工序(f)中制备的双链DNA，利用来自DNA(-)链的RNA聚合酶启动子序列使单链RNA(-)扩增，使扩增的单链RNA(-)与固相DNA(+)引物杂交，然后通过逆转录酶使DNA(+)链延长制备cDNA链-RNA链复合体的工序；(h)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(g)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备固相单链DNA(+)的工序；(i)使工序(h)中制备的固相单链DNA(+)与工序(b)中制备的液相cDNA(-)引物或工序(b’)中制备的液相通用引物在液相中接触，使单链DNA(+)与液相cDNA(-)引物或液相通用引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA(-)链延长，制备双链DNA的工序；(j)对工序(f)和工序(i)中制备的双链DNA进行定量的工序。