[发明专利]牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法无效
| 申请号： | 200910010092.0 | 申请日： | 2009-01-13 |
| 公开（公告）号： | CN101463071A | 公开（公告）日： | 2009-06-24 |
| 发明（设计）人： | 张振冬;王淑芬;邹亚男;张伟 | 申请（专利权）人： | 张振冬 |
| 主分类号： | C07K1/14 | 分类号： | C07K1/14;C07K14/46;C07K14/705 |
| 代理公司： | 大连东方专利代理有限责任公司 | 代理人： | 贾汉生 |
| 地址： | 116023辽宁省大连市沙*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | 牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法。从牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血混合；将其用PBS缓冲液稀释并与分离液混合，于4℃条件离心，将底层的红细胞沉淀用PBS缓冲液4℃离心洗涤以去除上清液。加入低渗缓冲液，置于4℃下使红细胞充分溶胀破膜。4℃条件下离心收集牙鲆红细胞膜沉淀。加入低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞膜沉淀打散，4℃条件下离心洗涤红细胞膜沉淀。加入膜蛋白裂解液，搅拌以充分裂解牙鲆红细胞膜，4℃下离心，上清即为牙鲆红细胞膜蛋白提取液。分装后于-80℃冰箱中保存。本发明的方法与现有技术相比更为简单，效率更好，既保证了膜蛋白制备的高效性，又保持了膜蛋白的生物活性。 | ||
| 搜索关键词： | 红细胞 膜蛋白 制备 方法 | ||
【主权项】：
1. 牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法，其特征在于操作步骤为：(1)用5mL一次性无菌注射器分别从4条体长20cm左右的实验牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血1:1～1.5混合，收集抗凝血冰盒中暂存；(2)将抗凝血用0. 1M PBS缓冲液1:1稀释，与比重为1.08～1.09的淋巴细胞分离液按1：2比例混合，于4℃条件下3000rpm水平离心15min；离心后外周血细胞分为4层，小心吸走上层的分离液、白细胞和血浆，将底层的红细胞沉淀用0.1M PBS缓冲液4℃离心洗涤3次，去除上清液；(3)向红细胞沉淀中加入20倍体积的低渗缓冲液，置于4℃条件下30min，使红细胞充分溶胀破膜，4℃条件下，12000rpm离心15min收集牙鲆红细胞膜沉淀；(4)向红细胞膜沉淀中加入10～15mL低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞膜沉淀打散，4℃条件下12000rpm，15min离心，得到经洗涤的红细胞膜沉淀，重复上述洗涤步骤2～4次；(5)向牙鲆红细胞膜沉淀中加入2～3倍体积的膜蛋白裂解液，磁力搅拌过夜，以充分裂解牙鲆红细胞膜，裂解过程于冰浴中进行；(6)裂解后所得溶液于4℃下，12000rpm离心30min，上清即为牙鲆红细胞膜蛋白提取液，分装后于-80℃冰箱中保存，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测牙鲆细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度。
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