[发明专利]一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法

摘要

本发明涉及一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法，是以种间杂交组合白河-35-1×佳利酿的双亲及F1代、F2代为试材，用随机引物OPS03进行扩增，获得约1300对碱基的脱氧核糖核酸片段，对该片段用pGEM-T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α，克隆该片段。经测序，该片段为1365对碱基。按照该序列，人工合成的一个寡聚核苷酸能检测亲本、杂种、欧洲葡萄及野生葡萄抗黑痘病基因的存在与抗黑痘病性状的表达，用作检测葡萄抗黑痘病基因的探针。本发明的分子标记可用作葡萄抗黑痘病育种的早期筛选鉴定；其碱基序列为研究葡萄抗黑痘病基因提供了依据；人工合成的寡聚核苷酸序列具检测葡萄抗黑痘病基因存在与表达的功能。

主权项

一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法，其特征是采用以下技术操作步骤进行：1.a以葡萄抗黑痘病育种的种间杂交组合白河-35-1×佳利酿的双亲、F1代及F2代为试材，提取、分离、纯化脱氧核糖核酸(DNA)1.b采用随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)技术，用Operon公司的随机引物196个，分别进行脱氧核糖核酸(DNA)的扩增，其中序列为5’CAGAGGTCCC 3’的随机引物OPS03可以扩增区分抗黑痘病与感黑痘病的杂种、亲本，获得了大小约为1300对碱基的脱氧核糖核酸(DNA)片段，该DNA片段是与葡萄抗黑痘病基因相连锁的分子标记；1.c用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取纯化该脱氧核糖核酸(DNA)片段；1.d以pGEM-T载体连接脱氧核糖核酸片段，4℃下保持16小时；1.e转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，并于37℃水浴中2小时进行酶切；1.f将鉴定为阳性克隆的菌液测定该DNA片段的碱基构成及其序列；1.g获得了该脱氧核糖核酸(DNA)片段的实际大小为1354碱基对的全部碱基组成及其序列，即获得了基因标记为1354碱基对的全部碱基组成及其序列；1.h进一步依据1354碱基对的全部碱基组成及其序列；1.i人工合成4个寡聚核苷酸，其中的1个寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′可用作引物；1.j对原杂交组合双亲及其F1代、F2代，中国野生葡萄，欧洲葡萄，美洲野生葡萄，以及杂交组合广西-1×京可晶的亲本及其F1代的脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行PCR扩增；1.k获得特异性脱氧核糖核酸(DNA)片段；1.l用上述方法回收、克隆、测序该DNA片断；1.m获得该特异性脱氧核糖核酸(DNA)序列大小为1110碱基对，即获得了基因标记为1110碱基对的序列；1.n人工合成的寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′用作引物，对原杂交组合双亲及其F1代、F2代，中国野生葡萄，欧洲葡萄，美洲野生葡萄，以及杂交组合广西-1×京可晶的亲本及其F1代的抗黑痘病性状可以检测出来，并以1110对碱基的脱氧核糖核酸(DNA)片段表现了拥有葡萄抗黑痘病性状和抗黑痘病基因；1.o确定人工合成的寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′作为检测葡萄抗黑痘病基因的DNA探针。