[发明专利]一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法

摘要

本发明提供了一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，属于生物工程技术领域。将蛹虫草菌种活化后，接种到一级种子罐，再进一步扩大到发酵罐，在发酵罐中达到一定生物量后加入生物型诱导子炭角菌属银杏内生真菌提取液，和非生物型诱导子乙酸钠、硫酸铵，促进菌体中虫草素的产生。本发明采用优化的培养基有效增加蛹虫草的菌丝生长量，并通过诱导子调控作用，蛹虫草生物量和菌体中虫草素含量比未添加诱导子的对照培养基分别增加了1.76倍和7.14倍，比普通的改良PDA分别增加了2.35倍、23.25倍。大大提高了蛹虫草菌丝体的生产量和有效特征性成分的含量，有着广阔的市场前景。

主权项

1、一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，包括：1)生物型诱导子的制备：将炭角菌属银杏内生真菌(Xylaria sp.)YX-28菌株接种到PDA液体培养基中，PDA液体培养基为：土豆200g、葡萄糖20g、水1000mL、pH自然，25℃、120rpm黑暗培养7d，将培养物反复冻融3次后，在冰浴条件下于超声波细胞破碎仪中1200W、超声时间5s、间隔时间3s共处理5min，10000rpm离心10min，收集上清冷冻干燥，制成20mg/mL的储备溶液，最后经0.22μm滤膜过滤除菌，得生物型诱导子；2)非生物型诱导子制备：称取乙酸钠、硫酸铵，以体积比70％甲醇水溶液溶解，配制成浓度分别为0.07mol/L、0.056mol/L的混合溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，得非生物型诱导子；3)菌种活化：将PDA斜面保存的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到液体培养基中活化，黑暗条件下、20℃、摇床120rpm振荡培养5天，液体培养基为：土豆200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁1g、维生素B10.01g、水1000ml；4)蛹虫草发酵培养基：按糖蜜20g/L、玉米浆干粉10g/L、氯化钙0.25g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L称取各组分，以水溶解；5)10L一级种子罐培养：按照4)所述培养基配方，以7L体积计称取所需各组分，并按体积比2‰添加消泡剂，以2-3L水溶解后加入种子罐中，121℃蒸汽灭菌15min，控制灭菌后培养基体积为罐容积的60％；培养基冷却后，采用火圈接种法将活化好的菌液按体积比10％接种到种子罐中，种子罐温度20℃，搅拌速率100rpm，无菌空气流量0.75vvm，罐压0.1Mpa，培养3天；6)100L发酵罐培养：按照4)所述培养基配方，以70L体积计称取所需各组分，并按体积比2‰比例添加消泡剂，以40L水溶解后加入发酵罐中，121℃蒸汽灭菌15min，控制灭菌后培养基体积为罐容积的60％；培养基冷却后，通过压差法将种子罐中的种子液由专用管道转移到发酵罐中，20℃，搅拌速率100rpm，无菌空气流量0.75vvm，罐压0.1Mpa，培养96h后由补料口加入步骤1)中所述生物型诱导子过滤除菌的银杏内生真菌提取物，使终浓度为120μg/mL；继续培养，120h后由补料口加入步骤2)中所述非生物型诱导子至乙酸钠、硫酸铵的终浓度分别为0.5mmol/L、0.4mmol/L，继续培养至8天终止发酵。