[发明专利]毕赤酵母工程菌株的构建方法和右旋糖酐酶的制备工艺无效
| 申请号： | 200910039057.1 | 申请日： | 2009-04-28 |
| 公开（公告）号： | CN101638666A | 公开（公告）日： | 2010-02-03 |
| 发明（设计）人： | 梁达奉;曾练强;郭亭;卢英华;蚁细苗;李雨虹;陈龙军;张远平;黄玉南;钟映萍;敬科举 | 申请（专利权）人： | 广州甘蔗糖业研究所 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N9/46;C12R1/84 |
| 代理公司： | 广州市红荔专利代理有限公司 | 代理人： | 唐 弟 |
| 地址： | 510316广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明涉及基因工程领域和蛋白质的分泌表达领域，提出一种用于制造右旋糖酐酶的毕赤酵母工程菌株的构建方法，包括步骤：(1)设计寡核苷酸引物并以油脂酵母1390基因组DNA为模板；克隆得到右旋糖酐酶基因；(2)利用分泌表达载体pPIC9K，将右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位点(EcoRI和NotI)，构建出整合分泌型表达载体pPIC9K-139；(3)对重组表达载体pPIC9K-139线性化，实现右旋糖酐酶的高效分泌表达，筛选得到重组毕赤酵母工程菌株GS115-139。本发明成功实现右旋糖酐酶基因在毕赤酵母中的有效表达，构建了能高效分泌表达右旋糖酐酶的工程菌株；实现右旋糖酐酶的发酵工艺放大。 | ||
| 搜索关键词： | 酵母 工程 菌株 构建 方法 右旋糖酐 制备 工艺 | ||
【主权项】：
1.一种毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计寡核酐酸引物Primer1：GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2：ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG，引物中分别引入限制性内切酶EcoRI和NotI，以油脂酵母1390基因组DNA为模板，克隆得到右旋糖酐酶基因；(2)利用分泌表达载体pPIC9K，将双酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位点(EcoRI和NotI)，并通过连接、转化、酶切等分子生物学技术操作，构建出整合分泌型表达载体(pPIC9K-139)；(3)用限制性内切酶Bgl II，对重组表达载体(pPIC9K-139)线性化，电击转化毕赤酵母GS115，采用α-factor，实现右旋糖酐酶的分泌表达，在含有G418的YEPD平板上进行筛选，得到重组毕赤酵母工程菌株(GS115-139)。
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