[发明专利]一种结核分枝杆菌全基因组ORF克隆文库的构建方法及应用

摘要

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF细菌双杂交克隆文库的构建方法及应用。本发明的特征是，制备了一个适用于构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF克隆文库的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ，利用PCR反应获得结核分枝杆菌H37Rv的全部编码基因，通过将结核分枝杆菌H37Rv的全部编码基因精确克隆到本发明构建的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ中，转化大肠杆菌DH10B，得到结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF细菌双杂交克隆文库。

主权项

1.一种用于构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF克隆文库的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ，其特征在于，它是通过以下步骤获得的：1)将购于invitrogen公司的细菌双杂交载体pTRG上211位点的XbaI酶切位点消除，获得一个中间载体pTRG-XbaIΔ；2)将步骤1)获得的中间载体pTRG-XbaIΔ用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行消化；3)利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因MCM作为一个媒介基因，通过PCR的方法获得两末端分别含有EcoRI和XhoI酶切位点的MCM媒介基因；4)将步骤3)获得的MCM媒介基因用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行消化；5)将步骤2)获得的中间载体pTRG-XbaIΔ和步骤4)获得的MCM媒介基因在16℃的条件下连接过夜，得到中间载体pTRG-MCM；6)将步骤5)获得的中间载体pTRG-MCM用限制性内切酶BamHI充分酶切；7)将步骤6)酶切后的中间载体pTRG-MCM末端削平并自连接，获得改造的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ，其大小为5592bp，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。其中，步骤3)利用PCR扩增的MCM基因的引物对的序列如下所示：正向引物：GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC；反向引物：GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT。