[发明专利]一种多农兽药残留的高通量检测方法

摘要

本发明涉及一种多农兽药残留的高通量检测方法。环境和食品中多种农兽药残留已引起重视，为解决一些现有常规技术达不到对多残留快速、灵敏和准确地检测，建立一种新型多农兽药残留的高通量悬浮芯片检测技术和方法，改进了常规悬浮芯片技术，实现了一次检测可最多同时检出7种农兽药残留靶标物的目标；该技术还摒弃了常规悬浮芯片技术步骤繁琐、实验耗时长的不足，通过优化和筛选实验条件，基本达到抗原抗体的完全反应，检出限可最多达到pg级，检测区间2-4个数量级；该方法操作简单，灵敏快速，成本低廉，结果获得稳定可靠，整个检测过程仅耗时1～2小时，为多种农兽药残留的快速检测提供了新方法。

主权项

一种多农兽药残留的高通量检测方法，其特征是包括如下步骤：(1)待测农兽药靶分子蛋白结合物的制备：采用重氮化法将氯霉素、克伦特罗分别与载体蛋白BSA制成蛋白结合物；采用碳二亚胺法将吡虫啉与载体蛋白BSA制成蛋白结合物；采用活性酯法将甲萘威与载体蛋白OVA制成蛋白结合物；采用混合酸酐法将阿特拉津、雌二醇分别与载体蛋白BSA制成蛋白结合物；通过羰基二咪唑将泰乐菌素与载体蛋白BSA制成蛋白结合物；(2)待测农兽药靶分子蛋白结合物在羧基荧光微球上的偶联和确证1)将步骤(1)制备的待测农兽药靶分子蛋白结合物分别放入七支Eppendorf离心管中为实验管，并将所述步骤(1)中与待测农兽药靶分子结合的载体蛋白对应地放入另七支Eppendorf离心管中，为所述对应的实验管的阴性对照管，再向所述实验管和阴性对照管中加入1800～2300个偶联微球，以中速漩涡振荡12‑20s；2)在各实验管中加入相对应的生物素化抗体3～10μg；在阴性对照管中加入相同容积的磷酸盐缓冲液(Phosphate‑buffered saline，PBS)；于37℃孵育箱中速振荡反应1～2h；3)10000～16000g离心实验管和对照管3～5min，弃上清；4)加入100×稀释的链霉亲和素‑藻红蛋白(Strepavidin‑phycoerythrin，SA‑PE)，于37℃孵育箱中速振荡反应20～40min；5)将反应后的溶液移入96孔酶标板中，放进已预热的Bio‑PlexTM悬浮芯片仪，通过配套的Bio‑ManagerTM 4.0软件选取相对应的微球编码，上机读数，获得中位荧光强度值(Mean Fluorescent Intensity，MFI)；MFI＞1000，可确证偶联成功；(3)农兽药残留的悬浮芯片单通道检测方法建立将各种待测的农兽药标准品氯霉素、克伦特罗、吡虫啉、甲萘威、阿特拉津、雌二醇和泰乐菌素用水分别进行梯度稀释(梯度可详见说明书中的表1)，同时设不加任何标准品的阳性对照；加入新的96孔酶标板中，再在各孔分别加入相对应的生物素化抗体3～10μg；然后，各孔分别加入相对应的所述步骤(2)获得的偶联有蛋白结合物的荧光微球1800～2300个，反应1～2h，向每孔加入100×稀释的SA‑PE，37℃温育20～40min，悬浮芯片读取100个微球，由配套的Bio‑ManagerTM4.0软件分析处理，获得MFI，并采用Logistic回归方程获得7种待测农兽药的最小可检出浓度和检测区间；(4)高通量悬浮芯片同时对多农兽药残留的检测再重新取96孔酶标板加入各种待测农兽药的多种生物素化抗体3～10μg，多种农兽药标准品依次按照不同的浓度梯度进行稀释，将步骤(2)所获得多种微球等比例混合，每孔1800～2300个，最后每孔用PBS补足50μL，同时每种检测物准备一阳性对照，反应为漩涡振荡器上37℃中速振荡1～2h，然后每孔加入50×稀释的SA‑PE 50μL，25℃中速振荡反应0.5～1h，悬浮芯片读取100个微球，获得MFI，分析处理并做出7种待测农兽药检测标准回归曲线方程；(5)农兽药残留样品的检测分析准备若干种不同浓度的农兽药盲样，对每个盲样平行测试3次(n＝3)，用Bio‑PlexTM悬浮芯片系统检测出盲样中每种待测农兽药的MFI，由Bio‑ManagerTM 4.0软件根据步骤(4)绘制出的标准曲线计算出测试浓度值，测得被测样品中农兽药浓度。并将测试结果和实际浓度值进行比对。