[发明专利]一种制备重组几丁质酶的方法

摘要

本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备重组几丁质酶的方法，解决利用现有方法得到的几丁质酶产量低、纯度低、活性低等问题，根据几丁质酶基因CH的全长序列设计引物，在CH基因5`末端增加HIS标签序列HIS6，再将CH基因序列加HIS标签序列的基因克隆至pET-21b载体；再将分子伴侣PDI的全长序列克隆并连接到CH基因的3`末端；然后在PDI基因序列的前端加入蛋白酶切位点序列pp，重组成表达载体；将表达载体转化至大肠杆菌，诱导表达，用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整pH值，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出CH蛋白，得到含有重组几丁质酶的溶液，产品纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。

主权项

一种制备重组几丁质酶的方法，其特征是包括以下步骤：(1)根据几丁质酶基因CH的全长序列设计引物，在CH基因序列的5`末端增加HIS标签序列HIS6，再将CH基因序列加HIS标签序列的基因克隆进入pET-21b载体；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列克隆出来并连接到CH基因的3`末端；然后在PDI基因序列的前端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp，这样即重组成表达载体pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI，相应表达出的重组蛋白为HIS6-CH-pp-PDI；(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI转化至大肠杆菌Rosseta，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为7.0-8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出CH蛋白，得到含有重组几丁质酶的溶液；(4)将含有重组几丁质酶的溶液进行纯化处理，得到含有重组几丁质酶的精品。