[发明专利]一种固态发酵制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法

摘要

本发明提供了一种固态发酵枯草芽孢杆菌以制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其中，采用颗粒直径为20-40目、含水量30％的无霉变玉米芯灭菌后作为固态发酵培养基的固体基质。本发明的发明人克服了现有技术持有的“液态发酵枯草芽孢杆菌较固态发酵枯草芽孢杆菌更易从中分离嘌呤核苷磷酸化酶产品”的偏见，使用本发明的固态发酵方法可以实现从枯草芽孢杆菌中更高效分离嘌呤核苷磷酸化酶产品。本发明的方法耗能少，耗时少，得到的嘌呤核苷磷酸化酶产品活性高。

主权项

1.一种固态发酵枯草芽孢杆菌以制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)制备玉米芯固体基质将无霉变玉米芯粉碎后过20目筛收集筛下物，然后将所收集的筛下物过40目筛收集筛上物，得到20-40目颗粒直径的玉米芯固体基质；使所得玉米芯固体基质水分含量达30重量％；116-120℃灭菌60分钟；2)配制培养基的液体部分按照以下组分含量表配制培养基的液体部分：蛋白胨 5-50 酵母粉 2-50蔗糖 0.5-5.0 碳酸钙 5-100肌苷 5-10 硫酸铵 1.0-4.0磷酸氢二钠 1.0-3.0 磷酸二氢钾 1.0-3.0七水硫酸镁 0.05-0.1 pH 5.0-7.5其中，溶剂为水，单位为每升水中含有的克数，配制好的液体部分在116℃下灭菌20分钟；3)制备固体培养基并接种枯草芽孢杆菌种子液在无菌条件下，将以下a)、b)和c)混合：a)已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤1)得到的固体基质，b)已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤2)得到的液体部分，c)细胞密度为105-108个/ml的枯草芽孢杆菌种子液，其中，a)和b)的重量比范围为1∶1.7至1∶2.2，c)占a)与b)之和的5-10重量％；所得混合物以1-5厘米的厚度，在温度为25-36℃、湿度为70-90％、氧气浓度为环境空气中氧气浓度的1-2倍的条件下发酵15-24小时；4)分离玉米芯固体基质i)将步骤3)得到的发酵产物与浸提液按照1∶2.5至1∶3.0的重量比混合，浸提20-60分钟，然后搅拌至形成均匀分散体，其中，所述浸提液为含1％氯化钠的pH 7.6的0.1M的磷酸钾缓冲液；ii)将步骤i)所得均匀分散体通过40目不锈钢滤网过滤，分别收集滤液和滤渣；iii)将步骤ii)所收集滤液在8000G下离心25分钟，分别收集上清液和细胞沉淀；iv)取步骤iii)所收集的上清液与步骤ii)所述滤渣，重复上述步骤i)至步骤iii)三次，v)用pH 7.6的0.1M的磷酸钾缓冲液重悬步骤iii)和步骤iv)得到的细胞沉淀，并合所得细胞重悬液，其中，所述pH 7.6的0.1M的磷酸钾缓冲液与步骤3)得到的发酵产物的重量比为1∶1至1∶3；5)破碎细胞将步骤4)得到的细胞重悬液用高压匀浆机在600-850巴的条件下匀浆，所得匀浆液在8000G下离心15分钟，收集上清即粗酶液；6)酶的纯化对步骤5)得到的粗酶液进行以下A)和/或B)的操作：A)在50-60℃下热处理10-50分钟；B)加入硫酸铵使其终浓度达10-20％静置1-4小时，在8000G下离心20-30分钟，收集上清，弃去沉淀；在所收集的上清中继续加入硫酸铵使其终浓度达25-40％静置1-4小时，在8000G下离心20-30分钟，弃去上清，收集沉淀；其中，I)单独进行A)操作后，将所得悬浮液在15000G下离心25-30分钟，收集上清，弃去沉淀；II)单独进行B)操作后，将所得沉淀用1-3倍体积的、pH值为7.5的100mM的Tris-HCl缓冲液复溶；III)先完成A)操作时，将所得悬浮液在15000G下离心25-30分钟，收集上清，弃去沉淀；然后进行B)操作，最后将所得沉淀用1-3倍体积的、pH值为7.5的100mM的Tris-HCl缓冲液复溶；或者IV)先完成B)操作时，将所得沉淀用1-3倍体积的、pH值为7.5的100mM的Tris-HCl缓冲液复溶；然后进行A)操作，最后将所得悬浮液在15000G下离心25-30分钟，收集上清，弃去沉淀；7)酶液的脱盐将上述步骤6)中I)或IV)最终收集的上清或者II)或III)得到的重悬液用孔径为0.22-0.8μm的滤膜过滤，收集滤液在4℃下保存；葡聚糖凝胶G-25脱盐柱经pH值为7.5的50mM的Tris-HCl缓冲液过夜平衡后，用线性流速1.9厘米/分钟的速度将上样所述4℃下保存的保存滤液，并用pH值为7.5的50mM的Tris-HCl缓冲液以2.8厘米/分钟的速度洗脱，收集吸收波长在280nm处的蛋白单峰，合并吸收值在20％峰高以上的组分；8)酶的冻干将步骤7)收集到的组分加入甘露醇至其终浓度达0.5％，在零下35℃到零下40℃之间冷冻升华干燥至恒重即得嘌呤核苷磷酸化酶干粉。