[发明专利]一种基因定点多位点突变的方法

摘要

一种基因定点多位点突变的方法，包括以下步骤：根据突变的碱基所处序列的位点分别设计正向突变引物和反向突变引物，突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5’端的位置；再根据突变的位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；由第一对引物以含有甲基化位点的质粒为模版，以高保真酶进行第一轮PCR反应，扩增出含第一突变碱基的基因片段；采用DpnI酶将基因片段进行酶切，去除模板质粒，得到具有一个目标突变位点、有开口的环状质粒；再以环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物进行PCR反应，得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。本发明利用引物互补区对有开口的环状质粒模板完成聚合酶链式反应，从而引入多于一个位点的定点突变。

主权项

1.一种基因定点多位点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1根据突变的碱基所处序列的位点分别设计正向突变引物和反向突变引物，突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5’端的位置；根据需要进行突变的位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；S2由第一对引物以高保真酶进行第一轮PCR反应，扩增出含第一突变碱基的基因片段；S3采用DpnI酶将步骤S2中所得的基因片段进行酶切，去除模板质粒，得到具有一个目标突变位点、有开口的环状质粒；S4以步骤S3中的酶切产物为模板，加入第二对突变引物进行PCR反应：在第一个循环时，两条引物在高保真酶的作用下形成构成质粒一部分的新链；在第二个循环时，两条链分别与引物的互补区结合，在高保真酶的作用下，将每条链上缺失的部分补充完整，得到具有两个突变位点的产物；在经过多次这样的循环后，即得到多个拷贝、具有两个突变位点、有开口的环状质粒；S5以步骤S4中得到的环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物，按S4中的方式进行PCR反应，依次得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。