[发明专利]山羊支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法

摘要

一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法，采用以下方法和步骤制备而成：a制苗用培养基及其制备方法：制苗用培养基为改良KM2培养基；b增殖支原体的程序；c支原体灭活的程序；d疫苗配制程序采用一步乳化法，制成双相油乳剂疫苗；液相成分：占疫苗总量的45～50％，丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原按1∶1混合后，按抗原总量的1％加入1％硫柳汞溶液；油相成分：占疫苗总量的50～55％，ISA206油佐剂；乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)双相油乳剂灭活苗。本发明首次将这两种优势病原联合制备二联疫苗，可同时预防两种病原，避免了用单一病原制备疫苗顾此失彼的缺点，更适合我国生产实际。

主权项

一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，其特征在于含有丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原以及ISA206油佐剂，采用以下方法和步骤制备而成：a制苗用培养基及其制备方法：制苗用培养基为改良KM2培养基；a.1培养基成分：最低要素培养基MEM占总量的50％，1.7％水解乳蛋白Hank’s缓冲液占总量的35％，25％酵母浸液占总量的2％，健康马血清占总量的10％，1％醋酸铊溶液占总量的1％，2万IU青霉素占1％，0.4％酚红占总量的1％；a.2培养基制备方法：将1.7％水解乳蛋白Hank’s缓冲液、25％酵母浸液、1％醋酸铊溶液和0.4％酚红经10磅20分钟高压灭菌，冷却后加入滤过除菌的最低要素培养基MEM、健康马血清和青霉素，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.4～7.8，无菌分装，2～8℃保存备用；b增殖支原体的程序b.1支原体的增殖：将丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体分别接种改良KM2培养基，经3～5天培养，当培养物pH值下降至6.8～7.0时，按培养基总量的5％进行3～5次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6.8～7.0时，收获支原体菌液，测定生长滴度并进行超滤浓缩；b.2支原体的浓缩：用超滤膜系统将支原体菌液进行浓缩，使丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体菌液浓度均达到6.0～10.0×108ccu/ml；c.支原体灭活的程序c.1灭活：给已浓缩的丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体菌液分别加入浓度40％的甲醛溶液，使菌液中甲醛的浓度达到0.2％，在37℃下各持续灭活10小时，期间每2～4小时摇振1次，灭活终止，进行灭活检验；c.2灭活检验：将灭活的支原体菌液进行抽样，各接种改良KM2培养基2支，进行10倍系列稀释至10-5，置37℃培养10日，均无支原体生长者为灭活完全；d.疫苗配制程序采用一步乳化法，制成双相油乳剂疫苗；液相成分：丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原按体积比1∶1等比例混合后，按抗原总量的1％加入1％硫柳汞溶液；液相成分占疫苗总量的45～50％；油相成分：ISA206油佐剂，油相成分占疫苗总量的50～55％；乳化方法：先将206油佐剂进料到均质机内，再将液相成分进料，循环搅拌至充分混合，在36～38MPa压力下通过均质机，乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)双相油乳剂灭活苗。