[发明专利]一种提高辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法

摘要

本发明公开了一种提高辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法，属于利用细胞遗传学理论与育种技术领域。该发明在前人已发表的辣椒游离小孢子培养获得胚状体培养方法的基础上，通过提高培养用花蕾质量，采用从花蕾的取样、前期预处理、灭菌到花药剥取全程低温控制，并于7℃黑暗预培养一周后转到28℃黑暗培养的关键技术，使获得的胚状体最高达8.4个胚状体/花药，平均为1.3个胚状体/花药，高于公布的1个胚状体/花药的专利技术及国内目前报道的最高为1.83个胚状体/花药的研究。本发明的特点是：方法实用、步骤具体、适用的基因型广泛、重复性好，可实现辣(甜)椒游离小孢子培养在单倍体育种及创建遗传作图群体上的广泛应用。

主权项

一种提高辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法，包括以下步骤：(1)试材的确定：选取具有综合性状优良的辣(甜)椒基因型作为试验材料；(2)培养基的制备：基本培养基为Nitsch and Nitsch(1969)组分(引自J.P.Nitsch，C.Nitsch.Haploid Plants from Pollen Grains.Science，1969，1(3)：85-87具体成分详见列表)固体培养基-Nitsch组分+2％麦芽糖+1.0％活性炭+0.6％琼脂，pH为6.0，于高温121℃高压1.1Mpa条件下灭菌18分钟；液体培养基-Nitsch组分+2％麦芽糖+0.5ZTmg/L+1.0mg/LIAA，pH为5.8，以0.45μm和0.22μm微孔滤膜抽滤灭菌；分化培养基：Nitsch组分+2％蔗糖+0.9％琼脂，pH为6.0，于121℃，1.1Mpa条件下灭菌18分钟；(3)培养基的分装：于超净工作台上将已灭菌的固体培养基在凝固之前分装于已灭菌的60×15mm培养皿中，每皿5mL；待固体培养基凝固后，在接种花药前加入每皿3ml液体培养基备用；(4)花蕾的选择：在初花期和盛花期，通过铁钒—苏木精压片法镜检确定小孢子发育时期与外部形态的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾，此时花蕾的外部形态特征表现为花瓣等于或略大于花萼，并且花药尖端有10～25％呈淡紫色；(5)花蕾预处理：将选取的适宜花蕾置于4℃条件下处理1天；(6)花蕾消毒：在超净工作台上，用70％的酒精表面消毒30秒钟，之后用2％的次氯酸钠消毒10分钟，然后用无菌水冲洗3次，时间分别为1、4、10分钟；(7)花药的剥取：于超净工作台上，在无菌培养皿中用镊子从花蕾中剥取花药，彻底去除花丝，操作中尽量避免损伤花药；(8)花药接种：在装有固体培养基的培养皿中，加入液体培养基每皿3mL，之后接种花药12枚/皿，用Parafilm膜封口；(9)游离小孢子培养：将接种的培养皿进行暗培养；(10)胚状体的形成：培养期间各种类型的胚状体陆续出现，8周后将子叶胚接种于分化培养基上，形成再生植株；其特征是：(1)提高花蕾质量：培育壮苗、及时定植、合理肥水、及时摘取果实和已开放的花，保持植株旺盛的生长势；使适宜取蕾的初花期和盛花期处于白天温度25～30℃，夜间温度20℃左右的环境；(2)采用从培养基、花蕾的选择、花蕾预处理、花蕾消毒到花药剥取全程低温控制：液体培养基加入之前于4℃低温预冷保存；选择健壮植株的花蕾，晴天早晨8:00～10:00摘取适宜的花蕾用封口袋放于盛有冰的冰盒暂存；花蕾消毒用的酒精(70％)、次氯酸钠(2％)和无菌水使用之前皆在4℃低温预冷保存，消毒后的花蕾浸泡于无菌水中置于冰浴上备用；在超净工作台上，将无菌培养皿置于冰浴上剥取花药；(3)游离小孢子培养：将接种花药的培养皿置于7℃条件下暗培养一周后转于28℃下继续暗培养，经过12～18天后花药自然开裂，将小孢子释放于液体培养基中。