[发明专利]重组细胞致死性扩张毒素CdtB、其表达载体及其制备方法

摘要

本发明提供一种能原核表达cdtB基因的原核表达质粒pET-15b-cdtB构建方法，并经转化大肠杆菌感受态细胞TOP10和BL21(DE3)，IPTG诱导，体外诱导表达蛋白CdtB，该蛋白有望作为蛋白药物应用于肿瘤等疾病的治疗。并且本发明是克服现有的包涵体蛋白纯化过程中存在的问题，提供一种无需昂贵仪器，只需纯手工即可完成，且方法简便、耗时少、成本低、活性好，产品复性率可达80％以上。

主权项

重组细胞致死性扩张毒素cdtB的制备方法，其特征在于制备步骤为：a.目的基因cdtB的合成：设计上游引物5’‑CCGCTCGAGATGCAATGGGTAAAGCAATT‑3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点，下游引物5’‑CGCGGATCCTTAGCGATCATGAACAAAACT‑3’，带限制性内切酶BamH I酶切位点；分别以伴放线放线杆菌ATCC 29522、29523为模板，PCR扩增cdtB基因，PCR条件是94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，共30个循环，72℃延伸8min，PCR产物长度为：852bp；b.双酶切cdtB基因与带有6×His标签的载体pET‑15b，连接构建重组载体pET‑15b‑cdtB，转化宿主菌，构建cdtB基因工程菌，所述双酶切采用的是BamH I和Xho I，所述宿主菌为大肠杆菌；c.培养cdtB基因工程菌，体外诱导表达CdtB蛋白，以包涵体形式存在，清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液：所述培养cdtB基因工程菌为LB培养基，培养温度为37℃；所述体外诱导CdtB蛋白表达使用大肠杆菌BL21‑DE3，终浓度为0.1M的IPTG，诱导4h，温度为37℃；所述清洗、溶解包涵体是将工程菌超声破碎，离心收集沉淀，用溶液1、2清洗，溶液3溶解，溶液4析出蛋白，所述溶液1为2M尿素、1wt％Triton X‑100，所述溶液2为2M尿素，所述溶液3为8M尿素、0.1MβME，所述溶液4为PBS缓冲液；d.纯化包涵体：所述纯化包涵体是使用Ni‑HisTrap HP预装柱纯化，纯化过程中使用吸附缓冲液和洗脱缓冲液，利用Ni离子良好的螯合性能，吸附带6×His标签的CdtB蛋白，吸附条件为pH7.4；所述吸附缓冲液含有8M尿素、20mM磷酸钠和0.5M氯化钠，所述洗脱缓冲液含有8M尿素、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠和500mM咪唑；e.复性：所述复性采用透析法，形成浓度梯度降低变性剂尿素的浓度由原始浓度8M降至0M，透析液含有：pH 8.0‑9.020mMTris‑HCl、5g精氨酸和1g还原型谷胱甘肽，采用半透膜透析；f.超滤得到体外重组的CdtB活性蛋白：所述超滤为采用孔径0.2μM一次性滤膜超滤，‑80℃冻存。