[发明专利]同时检测乙型肝炎病毒三种核苷酸类似物耐药位点的方法及其试剂盒

摘要

本发明提供了一种同时检测乙型肝炎病毒三种核苷酸类似物耐药位点的方法及其试剂盒。该发明以乙型肝炎病毒基因型序列为基础，在HBV聚合酶区域设计了四条巢式扩增引物和针对十个耐药位点的二十七条野生、耐药检测的寡核苷酸探针，使用地高辛标记的寡核苷酸通用引物进行巢式PCR反应扩增靶DNA片段，利用被标记的靶DNA扩增产物与特异性寡核苷酸探针在基质上杂交，通过杂交结合物偶联的酶促显色反应，判断HBV对三种核苷酸类似物耐药的存在。该方法提高了检测的准确性、可靠性、灵敏度，可以同时检测三种核苷类似物的10个耐药位点，从而实现了高通量，多位点，经济，快速的检测，更加贴合临床需求。对实现早期监测，并合理指导临床个体化用药有着重要的意义。

主权项

一种同时检测乙型肝炎病毒三种核苷酸类似物耐药位点的方法，包括以下步骤：(1)从乙型肝炎病毒阳性的血清或血浆中提取HBV DNA基因组；(2)根据国内外文献报道的拉米夫定，阿德福韦，恩替卡韦三种核苷酸类似物代表性药物的耐药氨基酸替换及相应碱基突变，在聚合酶区域设计寡核苷酸通用引物并用地高辛标记，另在相应耐药位点设计特异性野生和耐药突变探针；(3)使用被标记的通用引物进行PCR反应扩增靶DNA片段；(4)寡核苷酸探针加多聚核苷酸尾链，固定在基质上，依次经紫外交联和80℃烘烤固定；(5)使用被标记的靶DNA扩增产物与固定于基质上的特异性寡核苷酸探针杂交；(6)通过杂交结合物上带有的碱性磷酸酶的酶促反应显色与否，来判断HBV对三种核苷酸类似物耐药的存在与否；其中所述步骤(2)所设计用于PCR反应扩增的地高辛标记的外引物是：HBV 570F   5’-TGTTGCTGTACAAAACCT-3’SEQ NO 1HBV 1180R  5’-TCAGCAAACACTTGGCA-3’ SEQ NO 2内引物是：HBV 610F  5’-TGTATTCCCATCCCATCATC-3’ SEQ NO 3HBV 998R  5’-CCCARAAGMCCCACAATTC-3’  SEQ NO 4所述步骤(2)设计的探针是：扩增控制探针：HBV 690R  5’-CGAACCACTGAACAAATGG-3’      SEQ NO 5显色控制探针：5’-TGTATTCCCATCCCATCATC-3’ SEQ NO 327条针对相应10个耐药位点的特异性探针：I169：5’-CCATAGGWATYTTGCGA-3’SEQ NO 6169T：5’-CCATAGGWGTYTTGCGA-3’SEQ NO 7V173：5’-GAGGCCCACTCCCATAG-3’SEQ NO 8173L：：5’-GAGGCCCARTCCCATAG-3’ SEQ NO 9173G：  5’-TGAGGCCCCCTCCCATA-3’ SEQ NO 10L180：  5’-CTGAGCCARGAGAAACG-3’ SEQ NO 11180M：  5’-CTGAGCCATGAGAAACG-3’ SEQ NO 12A181：  5’-AAACTGAGCCARGAGAA-3’ SEQ NO 13181T：  5’-AAACTGAGTCARGAGAA-3’ SEQ NO 14181V：  5’-TAAACTGAACCARGAGA-3’ SEQ NO 15T184：：5’-TGGCACTAGTAAACTGA-3’ SEQ NO 16184G：  5’-TGGCACTACCAAACTGA-3’ SEQ NO 17S202：  5’-CCATATAACTGAAAGCC-3’ SEQ NO 18202I：  5’-CCATATAAATGAAAGCC-3’ SEQ NO 19202G：  5’-CATATAACCGAAAGCCA-3’ SEQ NO 20M204：  5’-ATCATCCATATAACTGA-3’ SEQ NO 21204V：  5’-ATCATCCACATAACTGA-3’ SEQ NO 22204I：  5’-ACATCATCDATATAACT-3’ SEQ NO 23204S：  5’-CATCATCCGAATAACTG-3’ SEQ NO 24Q215：  5’-TCAAGRTGTTGYACAGA-3’ SEQ NO 25215S：  5’-TCAAGRTGTGAYACAGA-3’ SEQ NO 26N236：  5’-GGGTTYAAATGTATACC-3’ SEQ NO 27236T：  5’-GGGGTYAAATGTATACC-3’ SEQ NO 28M250：5’-ATTACATATCCCATRAA-3’SEQ NO 29250V：5’-ATTACATATCCCACRAA-3’SEQ NO 30250I：5’-ATTACATATCCDATRAA-3’SEQ NO 31250L：5’-ATTACATATCCCARRAA-3’SEQ NO 32