[发明专利]一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法

摘要

本发明公开一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法，包括以下步骤：1)菌体的培养与收集；2)原生体的制备；3)细胞的裂解和质粒的提取；4)质粒的纯化。应用该方法得到的质粒DNA可直接用来限制性内切酶消化、PCR扩增等多种分子生物学实验。本发明操作简便、安全、质量高，可同时适用于多种革兰氏阳性细菌质粒DNA的提取，因此具有广泛的适用性。

主权项

一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)菌体的培养与收集：挑取苏云金芽胞杆菌的单菌落于5-10ml LB液体培养基中30℃振荡培养过夜，1wt％转接到50-100ml新鲜LB液体基中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD600＝0.9-1.1，收集约80-120mg菌体于1.5ml离心管中；2)原生体的制备：向收集的菌体中加入1-1.2ml预冷的溶液A悬浮细胞，12000g离心，去上清。菌体重悬于200-300μl溶液B，37℃温育1.5-2h；3)细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的原生质体中加入200-300μl溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100-150μl溶液D，轻轻混匀，于-20℃中放30min；4℃12000g离心20min，将上清液转移至新1.5ml离心管内，加入1ml无水乙醇，-20℃过夜；4℃12000g离心20min，弃上清，70wt％乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入200μl无菌纯水溶解沉淀；4)质粒的纯化：向上述DNA溶液中加入150-250μl的溶液E，轻轻混匀；再加入150-250μl的Tris饱和酚，轻轻混匀；加入150-250μl的氯仿/异戊醇，轻轻混匀；12000g离心3min，小心将上层水相转移到一个新的离心管中，加入800μl无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min；12000g离心10min，弃上清，70wt％乙醇洗涤沉淀，室温晾干；加入40-70μl溶液F，室温放置10min；