[发明专利]用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA间接提取方法

摘要

本发明公开了一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA间接提取方法。利用细菌的平均密度远小于土壤矿物质的平均密度，在细胞裂解以前对样品进行前处理，将微生物细胞从它们土壤样品中分离出来，避免了纯化步骤存在腐殖质去除困难和DNA回收率低的问题。本发明提取过程不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体健康伤害、所获DNA完整，分子片段大于10kb，产量高。所提取的土壤微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接应用于分子操作，以评价植物根系微生物群落多样件。

主权项

一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA间接提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向0.1-5g土壤样品中加入0.1-5ml预冷的无菌水混匀后，漩涡震荡5-20分钟分钟，然后加入0.1-5ml匀浆缓冲液A，漩涡震荡5-20分钟，低速50-400g室温离心10min，收集上清液转移至另一离心瓶中；(2)向由上述步骤(1)得到的沉淀物中加入0.2-10mL预冷的匀浆缓冲液B洗涤重悬，漩涡震荡5-20分钟，低速50-400g室温离心10min，取上清液，与步骤(1)所得上清液合并；(3)将由上述步骤(2)得到的上清液，室温下6000-15000rmp离心10-60分钟以回收菌体细胞；(4)向由上述步骤(3)得到的菌体细胞中1-150ml的洗涤液C，洗涤2-10分钟，室温下6000-15000rmp离心10-60分钟以沉淀菌体细胞，其中洗涤液C为1g/L焦磷酸钠；(5)向由上述步骤(4)得到的菌体细胞加入160ul溶菌酶和20ul蛋白酶K，37℃水浴10-40min，然后加入100-500μl细胞裂解液D到样品中，轻轻颠倒混匀1-10分钟，6000-15000rmp离心5-10min，沉淀碎片；(6)将由上述步骤(5)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5-10分钟，8000-15000rmp离心3-10min以沉淀蛋白质；(7)将由上述步骤(6)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min；(8)将由上述步骤(7)得到混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置1-5min，3000-10000rmp离心1-3min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕；(9)将由上述步骤(8)收集管中结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。(10)将由上述步骤(9)收集管中结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，8000-15000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次；(11)将由上述步骤(10)收集管中结合柱重新放回收集管，8000-15000rmp离心1-5min；(12)将由上述步骤(11)收集管中结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I，不要戳破膜，室温放置2min，8000-15000rmp离心1-3min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。其中洗脱液I为0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0。