[发明专利]侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法

摘要

本发明提供一种快速鉴别番茄上两种类似病毒(番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒)的方法，属植物保护领域。根据番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒核苷酸序列设计三条引物，PA_F362，TY_F833，PATY_R，其中PA_F362/PATY_R组合检测中国番木瓜曲叶病毒，TY_F833/PATY_R组合检测番茄黄化曲叶病毒。样品提取总DNA后，只需一次PCR，即可实现番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒两种病毒的鉴别。该方法克服了传统的生物学、血清学、电镜观察等方法上存在的问题，与传统的一次PCR检测一种病毒的方法相比，又减少了成本，节约了时间，是一种特异、灵敏、经济而又方便的检测方法。

主权项

侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法，包括以下步骤：(1)引物设计：①根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez db＝nucleotide)上已报道的番茄黄化曲叶病毒核酸序列(GU111505)和中国番木瓜曲叶病毒核酸序列(EU874386)设计引物，引物序列如下：PA_F362：5`-GCACCACTCACATTCTCGGAAAC-3`TY_F833：5`-GGTCTACACGCTTACGCCTTATT-3`PATY_R：5`-TTCCATCCGAACATTCAGGCAGC-3`②引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：引物组合          检测病毒名称          目的片段大小PA_F362/PATY_R    中国番木瓜曲叶病毒    362bpTY_F833/PATY_R    番茄黄化曲叶病毒      833bp(2)总DNA提取：取10mg番茄病叶于1.5mL离心管，加100μL0.5mol/LNaOH，匀浆后5000rpm离心5min，上清液用0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)稀释100倍，取1μL作为模板进行PCR扩增。(3)PCR扩增：PCR反应体系包括：DNA                  1μL10×PCR缓冲液        2.5μLdNTPs(10mM/dNTP)     0.5μLPA_F362(10μmol/L)   1μLTY_F833(10μmol/L)   1μLPATY_R(10μmol/L)    1μLTaqDNA聚合酶(5U/μL) 0.5μLddH2O                17.5μL总体积               25μL反应条件为94℃预变性10min；94℃变性45sec、53-59℃退火45sec、72℃延伸1min，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。(4)电泳检测：取10μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感染番茄黄化曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条833bp的核酸条带，在仅感染中国番木瓜曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条362bp的核酸条带，在同时感染番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到362bp和833bp两条核酸条带。