[发明专利]一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌DNA目标序列设计了捕获探针DNA1和识别探针DNA2，并构建了基于普通玻片表面两探针串联的DNA检测模型。将长寿命发光的稀土铕配合物作为识别探针DNA2的标记物，利用时间分辨荧光的方法能有效消除生物体系内源荧光和固体基质背景光的干扰。本发明通过严格控制杂交实验因素与洗涤条件等措施，经过大量、反复的实验研究，得到了该杂交体系的最佳检测条件，并获得了满意的特异性和灵敏度，为金黄色葡萄球菌的检验方法提供了科学系统的参考条件。本发明用时短，反应结果直观、灵敏、准确，具有十分显著的优点。

主权项

一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于：A、捕获探针DNA1的固定先将玻片醛基化，再将碱基序列为5’-CAC TTT TTC TTA AAT GTT GTT CTTTTTTTTTT-3’-NH2的捕获探针DNA1稀释到1×10-7mol/L，取40μL DNA1滴加到己醛基化的玻片表面，室温反应3h；最后洗涤并封闭剩余的醛基；B、稀土铕配合物标记识别探针DNA2(1)将2mg稀土铕配合物Eu(TTA)3phen分散到5mL 2.5％戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡5h，离心后用二次蒸馏水洗3次，得到醛基修饰的Eu(TTA)3phen颗粒重新悬于4mL pH为7.2的PBS溶液中备用；(2)再将碱基序列为NH2-5’-TTTTTTTTTT ATT TTC TCT TTT TTC GCT T-3’的识别探针DNA2配成使用浓度15μg/mL，将识别探针DNA2加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液中，30℃下于震荡培养箱中反应5h，反应完成后离心洗涤；再分散于2mLPBS缓冲液中备用；C、金黄色葡萄球菌DNA提取D、杂交(1)杂交反应前，将提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA通过高温解链使其变性成为单链；(2)将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA2与提取的待测单链DNA在固定了DNA1的玻璃片上杂交9h。杂交体系中的组分为10μL提取的单链DNA，10μL标记了稀土铕配合物的DNA2和10μL 12×SSC溶液；保持杂交温度为53℃；(3)杂交后，将玻片依次在以下3种洗涤液中清洗，洗涤液I(1×SSC/0.03％SDS)、洗液II(0.2×SSC)和洗液III(0.05×SSC)，总洗涤时间为4.5分钟，每次1.5分钟，洗涤温度为53℃；E、杂交后信号检测杂交清洗后带有稀土铕配合物标记的识别DNA2、捕获DNA1和目标DNA探针形成的杂交体，在激发和发射狭缝均为8.0nm，延迟时间0.1ms，门时间1.0ms；激发波长为368nm的检测条件下产生一个发射波长为612nm光信号，检测出玻片上的稀土长寿命发光配合物的光信号，从而根据检测的光信号检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌DNA。