[发明专利]一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶的制备方法

摘要

一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶(13-HPL)的制备方法，属于利用盐析、色谱分离技术和膜分离技术纯化膜蛋白技术领域。本发明包括苋菜13-HPL冻干微粒体酶的制备、初步纯化、电泳纯纯化；制备苋菜13-HPL冻干微粒体采用新鲜苋菜为原料，经均浆、离心后取沉淀和保护剂蔗糖(1-30％)溶液共同冷冻干燥可得冻干微粒体酶。此冻干粉体积小、可在-20℃下长期保存；酶回收率、活力高，解决了原料季节性依赖。纯化工艺步骤主要包括微粒体酶的洗涤，溶解，硫酸铵沉淀，透析，微滤，羟基磷灰石柱层析，阴离子交换柱层析和超滤得到电泳纯氢过氧化物裂解酶。苋菜13-HPL在高附加值食品、日化用品生产方面越来越引起重视，这是首次从中国种植苋菜中分离纯化得到氢过氧化物裂解酶。

主权项

一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶，简称电泳纯苋菜13-HPL，的制备方法，其特征在于步骤为：苋菜13-HPL冻干微粒体酶的制备、初步纯化、电泳纯纯化；(1)制备苋菜13-HPL冻干微粒体酶：以苋菜为原料，清洗并除去其中的泥沙及其它杂物，摘除根部和茎，沥干水分，将苋菜叶切成小片，苋菜叶与在0～10℃预冷的0.5～5倍体积/苋菜叶重量(v/w)的缓冲液A混合、且在组织捣碎机中均浆10s-300s，经四层纱布过滤；将纱布过滤液在0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取沉淀溶于10～50倍体积/沉淀重量(v/w)的缓冲液B，分装，冷冻干燥36～108h得冻干苋菜13-HPL微粒体酶；(2)初步纯化：冻干苋菜13-HPL微粒体酶经洗涤，溶解，硫酸铵沉淀，透析，微滤获得初步纯化苋菜13-HPL；步骤为：取冻干苋菜13-HPL微粒体酶粉加入8-12倍酶粉量(v/w)的缓冲液C，洗涤去除酶粉中所含蔗糖和色素，于0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取沉淀；沉淀溶于磷酸钠缓冲液D，于0～4℃，5000～50000g离心10～60min，取上清；上清液加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度达10％～50％，于0～4℃，5000～50000g离心10～60min，取沉淀；沉淀用缓冲液D于0～4℃透析过夜，并在5000～50000g离心10～60min，取上清；上清液过0.22μm微孔滤膜，透过液即为初步纯化苋菜13-HPL；(3)电泳纯纯化：将初步纯化13-HPL经羟基磷灰石柱，阴离子交换柱，超滤浓缩，得分子量为55KD电泳纯的苋菜13-HPL；步骤为：取初步纯化苋菜13-HPL上羟基磷灰石柱，用含0.01～0.4mol/L磷酸根的缓冲液D阶段洗脱收集活性组分；经超滤管浓缩脱盐后上DEAE-Toyopearl离子交换柱，后用含0～0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液E阶段洗脱，收集活性组分，经超滤管浓缩，得电泳纯苋菜13-HPL；缓冲液A：含0.5％聚乙烯吡咯烷酮的0.1mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液；缓冲液B：含10mmol/L DTT和10％蔗糖的0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液；缓冲液C：0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液；缓冲液D：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的pH 6.8磷酸钠缓冲液；缓冲液E：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。