[发明专利]黄麻根系总蛋白双向电泳方法

摘要

本发明涉及一种黄麻的总蛋白质双向电泳方法，属于生物技术领域。是针对能够生存在沿海滩涂的黄麻根系总蛋白采用双向电泳技术进行分离，采用本技术方案对生长在沿海滩涂地的黄麻根系进行实验取得了很好的效果。目前，经过反复实验证明，采用双向电泳方法对其进行分离，分离得到蛋白点多，经PDQuest软件检测，蛋白点多于1100个，图谱清晰，无横纵纹现象，蛋白点圆，重复性好，是一套适用于黄麻根系总蛋白组分析的双向电泳方法。

主权项

一种黄麻根系总蛋白双向电泳方法，其特征在于按下列步骤进行：1)采集黄麻根系，超纯水清洗干净，用液氮罐装运回，在实验室-70℃以下保存备用；2)将2g黄麻根系迅速放入冰浴的研钵中加入液氮研磨，研磨过程中加入0.2g聚乙烯吡咯烷酮，直到研磨成细粉，转入预冷-20℃的50ml离心管；3)加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-20℃1.5h，三氯乙酸提取液配制：质量体积比10％三氯乙酸TCA，质量体积比0.07％二硫苏糖醇DTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，溶剂为丙酮；4)35000g，4℃离心15min，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃1h，期间间隔涡旋；样品洗涤液配制：质量体积比0.07％DTT，1mMPMSF，溶剂为丙酮；5)20000g，4℃离心15min，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃1h，期间间隔涡旋；6)重复步骤5)一次；7)20000g，4℃离心15min，去掉上清后，用滤纸封口，真空干燥；8)将粗蛋白溶于裂解液，室温1.5h；裂解液配制：7M尿素、2M硫脲、质量体积比4％3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、1mM PMSF、体积比0.2％载体两性电解质；9)离心，得到上清液用3倍体积预冷的样品洗涤液-20℃沉淀0.5h后再20000g、4℃、15min离心，弃上清液；10)沉淀再次溶解于步骤8)中的500μl裂解液，充分溶解后，离心，取上清；11)蛋白质定量：采用Bradford法测定其蛋白浓度；12)第一向等电聚焦电泳：按上样量350μg，上样体积330μl，对已定量好的蛋白样品进行稀释，上样水化液同步骤8)中的裂解液，将样品加入固相pH梯度IPG胶条聚焦盘内后，再将pH 4-7，17cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液间的气泡，用2.5ml矿物油/条，覆盖胶条，进行等电聚焦；13)胶条平衡：将聚焦好后的固相pH梯度IPG胶条进行平衡I、II，每次平衡时间为20min，平衡缓冲液配制如下：胶条平衡缓冲液母液：6M尿素，质量体积比2％十二烷基磺酸钠SDS，0.375MpH8.8的Tris-HCl，体积比20％甘油，溶剂为水。胶条平衡缓冲液I：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.2g DTT；胶条平衡缓冲液II：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.25g碘乙酰胺；14)第二向SDS-PAGE电泳：将平衡好的胶条置于胶浓度为质量体积比12％的SDS-PAGE胶上，用质量体积比0.5％、含有质量体积比0.002％溴酚蓝的低熔点琼脂糖封胶液封住顶部，按如下参数进行电泳：16℃恒温下，恒功率，先用1瓦/条，1.5h；再用15瓦/条，4～6h；15)染色方法：采用硝酸银法进行染色。