[发明专利]用于制备人重组胰岛素的方法

摘要

本发明涉及生物技术学并且可被用于生产人重组胰岛素，所述人重组胰岛素用来制备用于治疗胰腺糖尿病的药剂。提出了各种含有人工基因并编码人胰岛素前体的重组质粒DNA。使用异丙基-硫代半乳糖吡喃糖苷来诱导杂合多肽的生物合成，从而使得杂合多肽的诱导后水平等于或大于总细胞蛋白质的25％。根据所述的方法，通过培养含有所述重组质粒之一的生产菌株、分离包涵体、溶解并复性融合蛋白、以及酶促降解和层析纯化所述蛋白质而产生人胰岛素。本发明简化了生产人重组胰岛素的方法并且增加了其产率。

主权项

生产重组人胰岛素的方法，所述方法是介由构建编码胰岛素原的重组质粒DNA，产生和培养产生杂合多肽的大肠杆菌菌株，分离和破碎细胞以及分离多肽，对其进行酶促转化，然后纯化和分离所需的产物，所述方法的特征在于，编码包含人胰岛素原的氨基酸序列的杂合多肽的重组质粒DNA片段为表达载体pIK8 胰岛素原、或pMUT12、或pISYN2、或pCIM61或pDIM07的一部分或与前述DNA插入物之一杂交并且在表达时编码人胰岛素原前体，从而编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pIK8 胰岛素原质粒的一部分的重组质粒DNA片段具有下列序列：1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT1..........M..G..S..S..H..H..H..H..H..H..S..S..G..L..V..P..R..G..S..H.61........ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTG21.........M..R..F..V..N..Q..H..L..C..G..S..H..L..V..E..A..L..Y..L..V..121.......TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAG41.........C..G..E..R..G..F..F..Y..T..P..K..T..R..R..E..A..E..D..L..Q..181.......GTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTG61.........V..G..Q..V..E..L..G..G..G..P..G..A..G..S..L..Q..P..L..A..L..241.......GAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTC81.........E..G..S..L..Q..K..R..G..I..V..E..Q..C..C..T..S..I..C..S..L..301.......TACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG101........Y..Q..L..E..N..Y..C..N..＊..编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pMUT12质粒的一部分的重组质粒DNA片段具有下列序列：1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT 1..........M..G..S..S..H..H..H..H..H..H..S..S..G..L..V..P..R..G..S..H.61........ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTG21.........M..R..F..V..N..Q..H..L..C..G..S..H..L..V..E..A..L..Y..L..V..121.......TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGC41.........C..G..E..R..G..F..F..Y..T..P..K..T..K..R..G..I..V..E..Q..C..181.......TGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG61.........C..T..S..T..C..S..L..Y..Q..L..E..N..Y..C..N..＊...编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pISYN2质粒的一部分的重组质粒DNA片段具有下列序列：1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT1..........M..G..S..S..H..H..H..H..H..H..S..S..G..L..V..P..R..G..S..H.61........ATGCGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTGGTGGAAGCGCTGTATTTAGTG21.........M..R..F..V..N..Q..H..L..C..G..S..H..L..V..E..A..L..Y..L..V.121.......TGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAACGTGGCATTGTGGAACAGTGT41.........C..G..E..R..G..F..F..Y..T..P..K..T..K..R..G..I..V..E..Q..C..181.......TGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTACTGCAACTAA61.........C..T..S..I..C..S..L..Y..Q..L..E..N..Y..C..N..＊...编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pCIM61质粒的一部分的重组质粒DNA片段具有下列序列：1.........ATGCGAAAGAAGCGGAAGAAGAAGCGTTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTG1..........M..R..K..K..R..K..K..K..R..F..V..N..Q..H..L..C..G..S..H..L.61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAA21.........V..E..A..L..Y..L..V..C..G..E..R..G..F..F..Y..T..P..K..T..K..121.......CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTAC41.........R..G..I..V..E..Q..C..C..T..S..I..C..S..L..Y..Q..L..E..N..Y..181.......TGCAACTAA 61.........C..N..＊..编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pDIM07质粒的一部分的重组质粒DNA片段具有下列序列：1.........ATGGATGAAGACGAGGATGAAGCACGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTG1..........M..D..E..D..E..D..E..A..R..F..V..N..Q..H..L..C..G..S..H..L.61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAA21.........V..E..A..L..Y..L..V..C..G..E..R..G..F..F..Y..T..P..K..T..K..121.......CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTAC41.........R..G..I..V..E..Q..C..C..T..S..I..C..S..L..Y..Q..L..E..N..Y..181.......TGCAACTAA61.........C..N..＊..