[发明专利]一种POOL FQ-PCR联合检测肿瘤耐药基因的方法及其试剂盒

摘要

本发明提供了一种Pool FQ-PCR联合检测肿瘤多药耐药基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的方法及其试剂盒，为临床检测肿瘤多药耐药基因提供了新的方法，该检测过程包括：(1)采集待检测样品；(2)样品预处理和提取肿瘤多药耐药基因的mRNA并合成cDNA；(3)Pool FQ-PCR体外扩增法对样本进行检测：合成特定分型引物和荧光探针，用Pool FQ-PCR技术并用扩增反应液(PCR MIX)对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样品中肿瘤耐药基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的存在。

主权项

一种Pool FQ‑PCR联合检测肿瘤多药耐药基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的方法及其试剂盒，试剂盒采用的特异性引物和探针序列如下：MDR上游引物：5’‑CTGGACAAGCACTGAAAGATAAGA‑3’(SEQ ID NO.1)；MDR下游引物：5’‑CAACGGTTCGGAAGTTTTCT‑3’(SEQ ID NO.2)；MDR荧光探针：5’‑FAM‑TCTGGGAAGATCGCTACTGAAGCA‑TAMRA‑3’(SEQ ID NO.2)；MRP1上游引物：5’‑CGTTAGAGCCCAAAGTGGAATC‑3’(SEQ ID NO.4)；MRP1下游引物：5’‑AGTCGGCGGCGTAATTCTTA‑3’(SEQ ID NO.5)；MRP1荧光探针：5’‑FAM‑TGAGGCTGCCCCAAGACTCAGACTTG‑TAMRA‑3’(SEQ ID NO.6)；MRP2上游引物：5’‑CATCAAAGAAAGTGGAACAGGA‑3’(SEQ ID NO.7)；MRP2下游引物：5’‑TGCGTCTGGAACGAAGACTC‑3’(SEQ ID NO.8)；MRP2荧光控针：5’‑FAM‑CTGTTCCACTTTCTTTGATGAAACAA‑TAMRA‑3’(SEQ ID NO.9)；MRP4上游引物：5’‑GGTGGCTCAATCCCTTGTTT‑3’(SEQ ID NO.10)；MRP4下游引物：5’‑AAGGTGCTGTGAGCGGTCTT‑3’(SEQ ID NO.11)；MRP4荧光探针：5’‑FAM‑CCATAAACGGAGATTAGAGGAAGATG‑TAMRA‑3’(SEQ ID NO.12)；LRP上游引物：5’‑GGAGTCACCATGGCAACTGA‑3’(SEQ ID NO.13)；LRP下游引物：5’‑TTCTGGTCCAGCACATGGATAT‑3’(SEQ ID NO.14)；LRP荧光探针：5’‑FAM‑AGTTCATCATCCGCATCCCCCCATA‑TAMRA‑3’(SEQ ID NO.15)；BCRP上游引物：5’‑CCTCCACCTGTTAGTCCCATTT‑3’(SEQ ID NO.16)；BCRP下游引物：5’‑TGGTGCCACAACTCCTTGGT‑3’(SEQ ID NO.17)；BCRP荧光探针：5’‑FAM‑TCTCCGGCTGCACAGAAGGCATTTC‑TAMRA‑3’(SEQ ID NO.18)；GSTs上游引物：5’‑GCTCCACTACTTCAATGCACG‑3’(SEQ ID NO.19)；GSTs下游引物：5’‑CTTGTCCAAATCTTCTGCAGAT‑3’(SEQ ID NO.20)；GSTs荧光探针：5’‑FAM‑AGAATGGAGTCCACCCGGTGGCTC‑TAMRA‑3’(SEQ ID NO.21)；同时引入人glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase(GAPDH)，基因为内标，特异性引物和荧光探针如下：GAPDH上游引物：5’‑CAGGTGGTCTCCTCTGACTTCA‑3’(SEQ ID NO.22)；GAPDH下游引物：5’‑GTGGTCGTTGAGGGCAATG‑3’(SEQ ID NO.13)；GAPDH荧光探针：5’‑FAM‑ACACCCACTCCTCCACCTTTGACGC TAMRA‑3’(SEQ ID NO.24)。上述各引物合成后需经过HPLC的方法纯化，各荧光探针均在5’标记有Fam荧光素，作为报告基团，3’标记有Tamra，作为淬灭基团。