[发明专利]旋毛虫病斑点免疫金渗滤法诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种旋毛虫病斑点免疫金渗滤法诊断试剂盒，它采用金标-SPA为抗体标记标签，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导pMAL-c2X-Ts21/TB1重组菌、表达并纯化了旋毛虫Ts21基因编码蛋白(Ts21抗原基因，ORF17.20，GenBank登陆号U88239)，在硝酸纤维素膜(NCM)上以纯化后Ts21重组蛋白包被检测点T，以人IgG包被质控点C，建立了Ts21重组蛋白-斑点免疫金渗滤法(Ts21-DIGFA)，并组装成旋毛虫Ts21重组蛋白斑点免疫金渗滤法快速诊断试剂盒。本发明操作简单，有高度的敏感性和特异性，稳定性和重复性良好；加样后1min内即可观察判断检测结果，诊断结果准确明了，不会出现误判现象；适用于快速诊断及现场血清流行病学调查，易于大范围推广应用。

主权项

一种旋毛虫病斑点免疫金渗滤法诊断试剂盒，其特征在于：它包括下述制备步骤：第一步：制备Ts21重组蛋白根据GenBank核酸数据库中Trichinella spiralis Hypothetical ORF 17.20的基因序列，利用生物信息学软件Primer5.0设计引物，通过RT-PCR获取旋毛虫Ts-21基因，构建表达载体pAML-c2X-Ts21，转化大肠埃希菌TB1，获得阳性克隆pAML-c2X-Ts21/TB1；挑取pAML-c2X-Ts21/TB1单菌落至5mL含氨苄青霉素100μg/mL LB培养液中，37℃培养至OD600≌0.6，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.25mmol/L，37℃诱导培养4小时，离心收集菌体，超声破碎菌体，4℃，4320g离心10分钟后收集上清液；经Amylose树脂预装柱亲和层析纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定，得到纯化的Ts21重组蛋白；测定蛋白浓度、分装，-80℃保存备用；第二步：制备胶体金标记物采用枸橼酸三钠还原氯金酸法制备颗粒直径为15nm的胶体金溶液；调节胶体金溶液pH至5.8～6.0后过滤；将浓度为1mg/ml的待标记蛋白质溶液缓慢搅拌并分次加入胶体金溶液中，混合均匀，加1％聚乙二醇，使其终浓度为0.05％，然后离心纯化，得10％浓缩的胶体金标记物，4℃保存备用；第三步：制备试剂盒将硝酸纤维素膜(1)浸入1×PBST溶液30min～1h，取出室温晾干，在膜(1)上压出2个排列设置的圆圈，用移液器将人IgG包被在其中一个圆圈的圆心处，记为质控点C；在另一个圆圈的圆心处包被第一步所得的Ts21重组蛋白，记为检测点T；包被完毕室温晾干后，将硝酸纤维素膜(1)浸泡于含1％牛血清白蛋白的封闭液中，4℃封闭过夜，次日取出，经洗涤、室温干燥，再放入烘箱内完全干燥后密封于塑料袋中，4℃保存备用；取上盖开设有观测窗口(2)的盒体(3)，在盒体(3)底部垫入吸水滤纸(4)，最上层放置上述包被有抗原的硝酸纤维素膜(1)，盖上上盖后，膜(1)上的质控点C和监测点T从上盖的观测窗口(2)露出，然后将其密封后4℃保存备用。