[发明专利]Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法

摘要

本发明涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法，属Leber遗传性视神经病变研究技术领域。本发明基于AS-PCR的原理，将突变特异的引物3′端第一位设计成T碱基H3635，同时在引物3′端第四位引入一个错配碱基(碱基A突变成碱基T，形成T/T错配)，在线粒体DNA序列的1138-1782区域，设计一对内参引物L1156/H1782。采用上述两对引物(L3179/H3635和L1156/H1782)，在单个PCR反应中对待测标本DNA样品进行扩增。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，依据突变特异的电泳图谱对G3635A突变进行基因分型，实现基因的快速检测。本发明具有简单、快速、经济、灵敏的特点。本发明对于Leber遗传性视神经病变的遗传研究及咨询具有重要的意义。

主权项

1.一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法，包括基因组DNA提取、引物设计、PCR扩增、电泳检测步骤，其特征在于本方法的具体步骤如下：(1)使用常规酚/氯仿法从临床样本中提取基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应引物为：PCR反应体系：总体系为20μL，包含50ng基因组DNA，PH为8.3的10mMTris-HCl，1.5mM MgCl₂，50mM KCl，0.5U TaKaRa rTaq，175μM dNTP，突变特异引物L3179和H3635各0.15μM，内参引物L1156和H1782各0.075μM；PCR反应程序：94℃，预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸7min；(3)PCR产物检测：取PCR产物2μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压电泳30min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照；(4)灵敏度检测：能检到的最低水平的突变DNA的浓度：以1ng、2.5ng、5ng、10ng的含有G3635A突变的DNA为模板，用与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测；能检到的最低水平的突变异质性：将正常人DNA样本与含有G3635A突变的患者DNA样本在总量为50ng的情况下按设定比例混合，使突变的DNA样本比例分别为5％、10％、15％和20％，将混合好的DNA模板按照与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。