[发明专利]基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法无效
申请号: | 201010103458.1 | 申请日: | 2010-01-27 |
公开(公告)号: | CN102051376A | 公开(公告)日: | 2011-05-11 |
发明(设计)人: | 廖玉才;李和平;程琳;傅庭栋;瞿波;黄涛;涂金星 | 申请(专利权)人: | 华中农业大学 |
主分类号: | C12N15/82 | 分类号: | C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00 |
代理公司: | 武汉宇晨专利事务所 42001 | 代理人: | 王敏锋 |
地址: | 430070 湖*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | 本发明属于植物转基因技术领域。具体涉及一种甘蓝型油菜转基因的方法。本发明建立了适合以油菜子叶为外植体的叶绿体转化组织培养体系,通过基因枪转化法获得油菜叶绿体转基因植株。本发明还公开了利用油菜叶绿体片段为同源重组片段,构建油菜叶绿体特异性表达载体,对油菜叶绿体进行转化并获得转基因植株的方法。本发明为甘蓝型油菜的转基因提供了一种新途径。 | ||
搜索关键词: | 基于 油菜 子叶 叶绿体 转化 组织培养 体系 获得 植株 方法 | ||
【主权项】:
一种利用基因枪方法培育油菜叶绿体转基因的方法,其步骤包括培养基制备,引物设计、PCR扩增、载体构建和遗传转化,其特征在于,以油菜子叶为外植体,通过基因枪法将油菜叶绿体特异性表达载体导入受体油菜中,通过筛选及鉴定,得到叶绿体转化植株,其步骤如下:1)引物设计和载体构建:根据Genebank公布的拟南芥叶绿体基因组序列(登录号为NC000932),设计两对特异引物对F‑trnI、R‑trnI、F‑trnA和R‑trnA,以油菜叶绿体基因组为模板,用所述的引物对F‑trnI、R‑trnI、F‑trnA和R‑trnA扩增trnI和trnA基因片段,测序后作为同源重组片段,从质粒p‑aadA中分别用SmaI和EcoRV酶切获得筛选标记基因aadA,其序列如SEQ ID NO:X所示,调控序列,其序列如SEQ ID NO:Y所示,从质粒p‑Prrn中分别用SpeI和XhoI酶切获得启动子Prrn,从质粒p‑TpsbA中分别用SmaI和EcoRV获得终止子TpsbA,将所述的同源重组片段、启动子、筛选标记基因和终止子连接到载体pBluescript上,构建得到油菜叶绿体特异性表达载体pCL318‑5;所述的特异引物对F‑trnI、R‑trnI、F‑trnA和R‑trnA的DNA序列如下所示:F‑trnI:5’‑ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG‑3’,R‑trnI:5’‑ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC‑3’;F‑trnA:5’‑ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG‑3’,R‑trnA:5’‑TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG‑3’;2)应用基因枪方法转化油菜子叶,它包括以下步骤:1)外植体的获得:取饱满油菜种子经表面消毒后接种至B5基本培养基上,在25℃,2000Lux,16h光照/8h黑暗条件下生长4d,然后将子叶切下,黑暗条件下高渗 预处理4h;2)基因枪转化及筛选:将步骤1)的油菜子叶,进行基因枪轰击,每皿轰击2次,轰击后在黑暗条件下用B5培养基中恢复培养16h;3)愈伤组织的诱导及筛选:将恢复培养后的油菜子叶切成3mm×3mm的块状,转入附加10mg/l壮观霉素的愈伤诱导培养基B5D‑5S上,于25℃,2000Lux,16h光照/8h黑暗条件下诱导愈伤组织,每两周继代培养一次,共继代培养4次;4)愈伤组织的分化诱导:将步骤3)的绿色抗性愈伤组织接种到附加20mg/l壮观霉素的分化培养基BF3S上,于25℃下,2000Lux,16h光照/8h黑暗条件下培养至分化出绿色小芽,得到候选转基因苗; 5)再生芽的生根诱导:将步骤4)的得到的材料,在生根培养基B5‑N上和壮苗培养基B5上培养,筛选获得候选转基因植株;6)采用PCR、Southern方法检测PCR阳性株系,获得转基因植株。其中所述的培养基成分如下所述:发苗培养基B5:KNO3 2500mg/L,(NH4)2SO4 134mg/L,MgSO4·7H2O 250mg/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,NaH2PO4·H2O 150mg/L,EDTA‑Na铁盐43mg/L,MnSO4·H2O 10mg/L,H3BO3 3mg/L,ZnSO4·7H2O 2mg/L,NaMoO4·2H2O 0.25mg/L,CuSO4·5H2O 0.025mg/L,KI 0.75mg/L,CoCl2·6H2O 0.025mg/L,肌醇100mg/L,烟酸1mg/L,VB1 1mg/L,VB6 1mg/L,半胱氨酸10mg/L,蔗糖30mg/L,琼脂7g/L,补充水分至1L,灭菌前调pH至5.5;预培养培养基B5‑YKNO3 2500mg/L,(NH4)2SO4 134mg/L,MgSO4·7H2O 250mg/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,NaH2PO4·H2O 150mg/L,EDTA‑Na铁盐43mg/L,MnSO4·H2O 10mg/L,H3BO3 3mg/L,ZnSO4·7H2O 2mg/L,NaMoO4·2H2O 0.25mg/L,CuSO4·5H2O 0.025mg/L,KI 0.75mg/L,CoCl2·6H2O 0.025mg/L,肌醇100mg/L,烟酸1mg/L,VB1 1mg/L,VB6 1mg/L,半胱氨酸10mg/L,0.4mol/L甘露醇,蔗糖30mg/L,琼脂7g/L,补充水分至1L,灭菌前调pH至5.5;愈伤组织诱导和筛选培养基B5D‑5S:KNO3 2500mg/L,(NH4)2SO4 134mg/L,MgSO4·7H2O 250mg/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,NaH2PO4·H2O 150mg/L,EDTA‑Na铁盐43mg/L,MnSO4·H2O 10mg/L,H3BO3 3mg/L,ZnSO4·7H2O 2mg/L,NaMoO4·2H2O 0.25mg/L,CuSO4·5H2O 0.025mg/L,KI 0.75mg/L,CoCl2·6H2O 0.025mg/L,肌醇100mg/L,烟酸1mg/L,VB1 1mg/L,VB6 1mg/L,半胱氨10mg/L,2,4‑D 0.6mg/L,KT 0.2mg/L,壮观霉素10mg/L,AgNO3 3mg/l,蔗糖30mg/L,琼脂7g/L,补充水分至1L,灭菌前调pH5.5;分化和筛选培养基BF‑3SKNO3 2500mg/L,(NH4)2SO4 134mg/L,MgSO4·7H2O 250mg/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,NaH2PO4·H2O 150mg/L,EDTA‑Na铁盐43mg/L,MnSO4·H2O 10mg/L,H3BO3 3mg/L,ZnSO4·7H2O 2mg/L,NaMoO4·2H2O 0.25mg/L,CuSO4·5H2O 0.025mg/L,KI 0.75mg/L,CoCl2·6H2O 0.025mg/L,肌醇100mg/L,烟酸1mg/L,VB1 1mg/L,VB6 1mg/L,半胱氨10mg/L,6‑BA 1mg/L,KT 1mg/L,NAA 0.5mg/L,壮观霉素20mg/L,AgNO3 3mg/l,蔗糖 30mg/L,琼脂7g/L,补充水分至1L,灭菌前调pH至5.5;生根培养基B5‑N:KNO3 2500mg/L,(NH4)2SO4 134mg/L,MgSO4·7H2O 250mg/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,NaH2PO4·H2O 150mg/L,EDTA‑Na铁盐43mg/L,MnSO4·H2O 10mg/L,H3BO3 3mg/L,ZnSO4·7H2O 2mg/L,NaMoO4·2H2O 0.25mg/L,CuSO4·5H2O 0.025mg/L,KI 0.75mg/L,CoCl26H2O 0.025mg/L,肌醇100mg/L,烟酸1mg/L,VB1 1mg/L,VB6 1mg/L,半胱氨10mg/L,NAA 0.1mg/L,壮观霉素10mg/L,蔗糖30mg/L,琼脂7g/L,补充水分至1L,灭菌前调pH至5.5。
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