[发明专利]基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法

摘要

一种基因工程技术领域的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，通过从革兰氏阳性安全微生物宿主中克隆与透明质酸前体合成相关的基因(序列表中的SEQ ID No.31到SEQ ID No.43)；按照革兰氏阳性安全微生物宿主的基因密码子偏好性重新设计并合成透明质酸合成酶基因(序列表中的SEQ ID No.1到SEQ ID No.27)，并将与透明质酸前体合成相关的基因与优化的透明质酸合成酶基因组成基因表达盒，最后将基因表达盒转化革兰氏阳性微生物宿主菌，得到能分泌透明质酸的革兰氏阳性基因工程安全宿主菌，经发酵培养得到基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸。本发明大大提高了宿主细胞合成透明质酸的能力。

主权项

一种基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步、从革兰氏阳性安全微生物宿主中分离与透明质酸前体，即UDP‑葡萄糖醛酸以及UDP‑N‑乙酰‑葡萄糖氨的合成相关的基因，包括：UDP‑葡萄糖脱氢酶基因，即SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34；UTP‑葡萄糖‑1‑磷酸转移酶基因，即SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37；葡萄糖‑6‑磷酸变位酶基因，即SEQ ID No.38、SEQ ID No.39；葡萄糖‑6‑磷酸异构酶基因，即SEQ ID No.40；氨基转移酶，即SEQ ID No.41以及N‑乙酰基‑1‑磷酸‑葡糖氨‑尿嘧啶基转移酶基因，即SEQ ID No.42和SEQ ID No.43；第二步、按照步骤一所述的革兰氏阳性安全微生物宿主的密码子偏好性对SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48进行碱基替换，分别得到SEQ IDNo.1到SEQ ID No.27共27种不同的序列；第三步、将来自SEQ ID No.1到SEQ ID No.27中的任一种基因以及SEQ ID No.31到SEQ IDNo.43基因的一种以上的基因与组成型启动子或者可诱导启动子组成一个基因表达盒；第四步、采用电转化的方法、制备原生质体的方法或制备感受态细胞的方法将基因表达盒转化革兰氏阳性微生物宿主菌，用选择标记筛选，得到能分泌透明质酸的革兰氏阳性基因工程安全宿主菌；第五步、对革兰氏阳性基因工程安全宿主菌进行发酵培养，在培养阶段加入诱导透明质酸合成的诱导剂以提高透明质酸的合成水平，发酵结束后即从培养基中分离纯化得到基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸；所述的透明质酸由D‑葡萄糖醛酸与N‑乙酰基葡萄糖氨以双糖单元交替连接而成的直链大分子酸性粘多糖，其分子量为五万到五百万道尔顿。