[发明专利]一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法

摘要

本发明公开了属于生物育种技术领域的一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法。该方法涉及园艺作物结球甘蓝的小孢子植株再生及其双单倍体的诱导技术改进，包括以下步骤：(1)花蕾的选取和小孢子的分离；(2)诱导加倍成胚培养；(3)分化成苗与继代培养；(4)壮苗生根培养。本发明可大批量规模化生产结球甘蓝双单倍体，为育种提供大量的新基因型纯系。该方法受生长环境和基因型的影响小，出胚成胚率高，加倍效果好，成苗植株生长健壮，继代培养频次减少，生根后苗壮根粗，大田移栽成活率高。

主权项

一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)花蕾的选取和小孢子的分离选取处于单核靠边期的花蕾，将其消毒处理后在分离培养基中进行无菌破碎，离心分离后获得小孢子，所述分离培养基为含蔗糖浓度为140‑170mg/L的B5液体培养基；(2)诱导加倍成胚培养对分离后的小孢子进行诱导加倍培养，首先在启动培养基中同步进行启动培养和加倍诱导，30‑35℃的温度下暗培养24‑72小时，所述启动培养基为含有0.5‑100ppm秋水仙素加倍剂且蔗糖浓度为150‑180g/L的NLN液体培养基；将小孢子膨大率达70％的样品离心，弃上清液后添加成胚诱导培养基悬浮，其中，小孢子的悬浮密度为5×104‑5×105个/mL，然后进行成胚诱导暗培养，培养温度为22‑25℃，所述成胚诱导培养基为含有0.01‑1ppm的6‑苄氨基嘌呤和/或0.01‑0.5ppm的α‑萘乙酸且蔗糖浓度为130‑150g/L的NLN液体培养基；(3)分化成苗与继代培养A、分化成苗阶段：待胚状体至肉眼可见后将其转到温度为20‑28℃、转速为60rpm的摇床上旋转培养1‑3周，然后将胚状体接种于分化培养基上进行分化成苗，所述的分化培养基为含0.01‑1ppm的6‑苄氨基嘌呤和/或0.01‑0.5ppm的α‑萘乙酸，9‑15g/L琼脂的B5固体培养基；B、继代培养阶段：待成正常试管苗后，再转接至继代培养基上进行继代壮苗培养，所述的继代培养基为含0.01‑0.5ppm多效唑的B5固体培养基；分化成苗和继代培养两阶段的培养条件为：温度22‑25℃，光周期12‑20h/d，光照强度1500‑4000LUX；(4)壮苗生根培养待胚状体分化出茎叶，并成壮苗后，将其移至生根培养基上进行壮苗生根培养，直至苗壮根粗后移栽大田，所述生根培养基为含0.01‑0.5ppm多效唑、0.01‑0.5ppmα‑萘乙酸的MS固体培养基。