[发明专利]棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法

摘要

本发明是棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法，属于生物技术领域。将载玻片打孔做成培养花粉管的小室；将花粉在小室中培养，萌发出花粉管；低温孵育法将Fluo-3AM载入培养好的花粉管中；激光共聚焦扫描显微下观察花粉管的Ca2+动态变化。本发明建立了利用激光共聚焦显微技术研究棉花花粉管Ca2+浓度变化的方法，操作简单，标记效果好，将在棉花花粉管生长以及受精生殖研究中发挥重要作用，有重要的实际应用价值。

主权项

一种棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法，包括以下步骤：1)载玻片打孔将25.5×76.2mm，1mm-1.2mm厚的载玻片中间用电钻打出直径为1cm的圆孔，其中将孔一边用盖玻片封住，形成小室，粘附剂为指甲油；2)荧光探针Fluo-3AM的溶解50μg的Fluo-3AM，用44ml含有质量比20％surfactant pluoronic F-127的无水二甲亚砜溶解，配制成1mmol/L的母液；3)培养花粉管晴天上午收集刚开放花朵上的花粉，使其充分混合；每1ml培养液中加入5mg花粉粒将花粉和培养液混合；培养液质量比成分：0.01％硼酸+0.03％四水硝酸钙+0.02％七水硫酸镁+15％聚乙二醇8000+20％蔗糖，pH6.2，装入离心管内，使花粉粒充分混入培养液，28℃光照培养1-2h；4)低温孵育法装载荧光探针Fluo-3AM取1μL Fluo-3AM母液，加入到50μL培养过的花粉悬浮液中，振荡混匀至Fluo-3AM终浓度为20μmmol/L，置于4℃冰箱中低温孵育1-2h，然后用原培养基低速离心洗涤3次，以去除未装载进细胞内的Fluo-3AM，最后在温度25℃静置1-2h，使已进入细胞内的Fluo-3AM在胞内酯酶的作用下充分水解为能与游离钙离子结合的离子形态；5)激光共聚焦显微镜观察将装载有荧光探针Fluo-3AM的陆地棉花粉细胞悬浮液滴加在载玻片上的小池中，上面盖盖玻片；将载玻片放在配备50mV氩激光器的Zeiss LSM Leica TCS-SP2型激光共聚焦显微镜的载物台上，以Kr/Ar激光为激发光源，激发波长488nm，发射波长522nm，Nikon物镜20×/0.5，Nikon目镜10×/25，调节焦距选取视野内一个完整的花粉管，再调节微调直至花粉管图像清晰，通过计算机控制扫描和数据采集系统Timecourse，对该层面上钙离子荧光强度和分布随时间的变化情况进行观察，图像采集采用256×256像素，循环次数为73次，间隔5s，共计6min，采集的图象和数据记录于计算机中；6)图像处理储存于计算机中的图象文件，用与共聚焦激光扫描显微镜配套的Laser Pix分析软件Version 4.0对所获得的Timecourse扫描图进行分析：分别圈定一个顶端0-30μm的花粉管顶端区域A，顶端＞30μm的近顶端区域B和背景区C，经此软件读出花粉管顶端A，近顶端B和背景区C的钙离子荧光强度相对值，此荧光强度相对值的变化反映花粉管内游离Ca2+的浓度变化；用Excel软件导出此花粉管顶端和近顶端选定区域的相对荧光强度的变化值，以时间为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，即可作图，此花粉管顶端和近顶端选定区域的荧光强度值即代表相应区域游离Ca2+的浓度相对值。