[发明专利]一种香菇病毒检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种香菇病毒检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括①食用真菌病毒RNA提取试剂；②RT-PCR检测试剂为：包括dNTPs 100μmol/L、Tris-HCl缓冲液、提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物；③对照样品包括阳性对照样品和阴性对照样品，试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。检测步骤是：A、从待测样品香菇菌丝体或子实体中提取总RNA；B、以提取的总RNA为模板，用设计的引物分别对RNA进行RT-PCR扩增；反应中使用的反转录酶为M-MLV反转录酶，DNA聚合酶使用Taq酶或高保真DNA聚合酶Pfu；C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品。本发明检测灵敏度高，结果准确，早期对香菇病毒进行快速、灵敏、准确的检测，大大减少了香菇生产中病毒病造成的危害。

主权项

一种香菇菌病毒检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒它包括①、食用真菌病毒RNA提取试剂，包括液氮、十六烷基三甲基溴化铵提取液、2-硫醇基苯并噻唑、氯仿、异戊醇、0.1％w/v焦碳酸二乙酯、无水乙醇、70％v/v乙醇、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液pH 8.0；其中，十六烷基三甲基溴化铵提取液的配方为：2％w/v十六烷基三甲基溴化铵，2％w/v聚乙烯吡咯烷酮，100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 8.0，焦碳酸二乙酯处理的水配置，25mM乙二胺四乙酸，0.5g/L亚精胺，2.0M氯化钠，2％v/v巯基乙醇；②、RT-PCR检测试剂为：100μmol/L四种三磷酸核苷混合液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 8.8、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物；其中，酶混合试剂包含莫洛尼鼠类白血病毒反转录酶和DNA聚合酶Taq酶或高保真DNA聚合酶Pfu，两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.5-2；三对RT-PCR的特异性引物分别为：第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′；③对照样品包括阳性对照样品和阴性对照样品，阳性对照样品是武香异常株WL香菇菌丝体，试验确定含有香菇病毒颗粒和病毒核酸，阴性对照为浙江正常株JL-0香菇菌丝，试验确定不含病毒颗粒和病毒核酸序列，试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。