[发明专利]一种人小RNA-148a表达载体及应用

摘要

本发明提供一种人小RNA-148a表达载体，是根据人小RNA-148a的前体序列设计并合成寡核苷酸片段，装载入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体，具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2的互补寡核苷酸序列。本发明所述人小RNA-148a表达载体具有特异性过表达人小RNA-148a的特点，利用该载体转染结直肠癌细胞，诱导其凋亡，可在制备促进结直肠癌细胞凋亡药物中的应用。同时在制备以BCL2基因为靶基因的抗肿瘤药物中的应用。

主权项

一种人小RNA-148a表达载体，是根据人小RNA-148a的前体序列设计并合成寡核苷酸片段，装载入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体，具有SEQ ID №：1和SEQ ID №：2的互补寡核苷酸序列，SEQ ID №：1：5’-TGCTGAGGCAAAGTTCTGAGACACTCCGACTCTGAGTATGATAGAAGTCAGTGCACTACAGAACTTTGTCTC-3’SEQ ID №：2：5’-CCTGGAGACAAAGTTCTGTAGTGCACTGACTTCTATCATACTCAGAGTCGGAGTGTCTCAGAACTTTGCCTC-3’；通过以下方法构建：合成SEQ ID №：1和SEQ ID №：2两条寡核苷酸片段，将上述合成好的寡核苷酸用双蒸水溶解成100uM，各取5μl混匀，加入退火缓冲液2μl，用双蒸水补足20μl，95℃加热5分钟，然后放置室温自然冷却20分钟，将退火后的双链寡核苷酸稀释至10nM，取4μl与2μlpcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR载体混合，加入4μl连接缓冲液，用双蒸水补足20μl后16℃过夜，将连接产物加入200μl制备好的感受态大肠杆菌中，冰浴30分钟后42℃热激90秒后冰浴3分钟；加入800μl LB液体培养基，37℃，150转/分钟摇菌1个小时后取200μl菌液均匀涂布于大观霉素阳性的LB琼脂培养板上，倒置平板，37℃培养箱内12-16h，每个转化平板分别挑取3个克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡核苷酸序列一致。