[发明专利]一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2,3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育

摘要

2，3-BDO是一种重要的化工原料和医药前体，例如它可以脱水形成1，3-丁二烯，可用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯；酯化形式的2，3-BDO是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆品、洗液等。此外2，3-BDO还可作为风味物质添加到白酒和奶油中。2，3-BDO可以通过化学合成法和微生物生产法两种，由于2，3-丁二醇结构特殊，化学法生产2，3-丁二醇主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，成本高、过程繁琐、不易操作，所以一直很难实现大规模的工业化生产。随着石油价格的日益攀升，用微生物发酵法生产2，3-丁二醇并对其衍生物进行开发研究逐渐引起了人们的关注。发酵法生产2，3-丁二醇有许多优点：首先在成本上具有优势，化学法生产成本比较高；其次，发酵法具有对环境友好的特征，2，3-丁二醇作为有机合成中间体取代了许多的化合物和其它石化产品的市场，前景广阔，社会、环境效益显著，非常有利于该产品的广泛应用；第三由于发酵法生产2，3-丁二醇是以可再生资源为原料的，因此本身摆脱了对石化原料的依赖，具有很好的应用前景。目前，2，3-丁二醇的工业化主要是发酵法，有关研究国外进行的较早，取得的成绩比较显著，国内研究还处于初级阶段，目前国内外发酵法产2，3-丁二醇的研究常用的菌种大都是克雷伯氏菌，而克雷伯氏菌具有潜在的致病性，限制了其工业化的应用。本发明筛选到以葡萄糖为底物高产2，3-丁二醇的微生物菌株，对该菌进行了鉴定，确定其为枯草芽孢杆菌，是环境安全菌株具有较大的工业应用前景，对其发酵条件进行了初步研究，在5L发酵罐上的产量可以达到61.7g/L，为微生物发酵法产2，3-丁二醇的工业化提供了基础。

主权项

一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2，3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育，其特征是以从自然界土壤中筛选的菌株作为供试株，以葡萄糖为底物微生物法生产2，3-丁二醇，筛选得到的1株枯草芽孢杆菌菌株Bacllius subtilis 6-7，该菌能以葡萄糖为底物进行发酵，在发酵液中测得2，3-丁二醇；(1)菌株的筛选：菌种筛选：将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L pH 7.0)中富集，37℃，150r/min摇床10h，取不同稀释度稀释涂布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉18g/L pH7.0)上进行划线分离，37℃培养1d-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基，作初筛备用；从斜面上挑取菌株到种子培养基中培养，将用种子培养基培养到对数期的种子，按5％接种量加入到含有15％葡萄糖的发酵培养基中，然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液，离心，取上清液以备检测；(2)2，3-BDO定性检测：取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)鉴定萃取液中是否含有2，3-BDO。气质联用检测条件：采用的色谱柱温控程序为：首先在60℃下保温1min，然后以6℃/min的升温速率升至90℃并保持2min，最后以30℃/min的升温速率升至180℃，恒温2min。进样口温度为250℃，进样量为1μL，载气为高纯氦气，载气流量1.2mL/min，检测器温度为240℃；TraceMS质谱条件：EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30～500amu，发射电流为200μA，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIRT98谱库；(3)菌株鉴定提取出发菌株的基因组DNA以出发菌株的基因组DNA为模板，使用酵母菌16S rDNA的通用引物进行扩增正向引物为f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’反向引物为r：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mol/L的引物f和r各0.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5min，56℃退火90S，72℃延伸2min，94℃变性1min，循环30次；用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，电泳验证；连接到pMD18-T载体，转化E.coli JM109。经氨苄青霉素抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。