[发明专利]用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法

摘要

本发明公开了一种用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法，属生物技术领域，首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；构建由pGAP调控L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中发酵工程菌分泌表达L-阿拉伯糖异构酶。本发明生产成本低，发酵周期短，利用毕赤酵母的pGAP调控表达的L-阿拉伯糖异构酶有利于产物的纯化，解决应用天然产L-阿拉伯糖异构酶的菌株生产L-阿拉伯糖异构酶的成本较高、产物难于纯化等的问题，有利于L-阿拉伯糖异构酶的大规模生产。

主权项

一种用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于，其步骤如下：1)、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；2)、在L-阿拉伯糖异构酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控L-阿拉伯糖异构酶基因的由G418抗性基因作为筛选标记的毕赤酵母表达载体，将这一载体转化毕赤酵母基因组，并将转化物涂布于含G418≥300μg/mL的G418-YPD平板上；3)、从步骤2的G418-YPD平板上再挑选毕赤酵母重组子作为工程菌株；4)、将步骤3获得的工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵1～2d分泌表达L-阿拉伯糖异构酶；所述液体培养基是由以下组分组成：85％磷酸25～28ml/L、CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L、K2SO4 17～19g/L、MgSO4·7H2O 13～16g/L、KOH 3.5～4.5g/L、碳源15～45g/L、蛋白胨18～22g/L、Yeastextract 8～12g/L、PTM43～5ml/L；所述PTM4是由以下组分组成：CuSO4·5H2O 2.0g/L、NaI·2H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 3.0g/L、Na2MoO4·2H2O 0.2g/L、H3BO30.02g/L、CoCl2·6H2O 1.05g/L、ZnCl27.0g/L、Fe2(SO4)3·7H2O 22g/L、生物素0.2g/L、硫酸1ml/L。