[发明专利]48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，特别是指一种48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法。其中细胞融合、筛选杂交瘤细胞、单克隆抗体特异性筛选、单克隆抗体纯化保存、补体C3抗体的标记、单克隆抗体的矩阵点样、芯片的杂交等工艺步骤，解决了传统技术存在的费时、费力、结果重复性差等技术问题。此芯片可直接应用于医疗及科研机构对多种肿瘤进行检测和预防的研究，在临床诊断领域中具有极高的应用价值，单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前国外几乎所有的医疗机构都不同程度地采用了生物芯片技术来进行疾病的诊断和预防。用芯片技术进行肿瘤筛查和临床诊断具有省时、省力、简便、快速的特点，是现代社会发展的趋势。

主权项

48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法，其特征在于它包括如下工艺步骤：(1)细胞融合：将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞分别与48种致敏的脾细胞悬液按1∶10‑100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(2)筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第5‑10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(3)单克隆抗体特异性筛选：选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，分别与48种恶性肿瘤标志物抗原进行特异性和效价筛选。(4)单克隆抗体纯化保存：将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA‑FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1‑10mg/ml。(5)CY3标记抗体：用CY3荧光素标记补体C3抗体。(6)48种恶性肿瘤标志物单克隆抗体微阵列点样：一张芯片点48个点，每一种单抗一个点，每一个点的含量0.01‑1ng/ml。