[发明专利]藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，该方法包括以下步骤：(1)采样；(2)藏羚羊耳部皮肤组织原代培养；(3)传代与纯化；(4)细胞冻存；(5)细胞复苏。本发明通过建立原代培养、细胞传代、细胞冻存与复苏的方法，获得了高活力藏羚羊成纤维细胞系，为深入开展藏羚羊分子生物学及细胞生物学的相关研究提供了研究材料与技术支持。

主权项

一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤：(1)采样：从雌性成年藏羚羊个体的耳部取1cm2皮肤组织，并将其放入装有贮存液的离心管中；(2)藏羚羊耳部皮肤组织原代培养：将所述步骤(1)所得的藏羚羊耳部皮肤组织依次经含有双抗的杜氏磷酸缓冲液浸洗、含有双抗的D/F12培养液冲洗后，将样本组织块放入35mm培养皿中，剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的培养瓶中，均匀地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶倒置放在饱和湿度二氧化碳培养箱中，3h后翻转培养瓶，加入3～5mL D/F12培养液继续培养10～18天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞；(3)传代与纯化：将所述步骤(2)所得的原代细胞进行传代培养；首先将原代细胞用磷酸盐缓冲液清洗，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，得到消化液A；然后将所述消化液A放入饱和湿度二氧化碳培养箱2～3min，取出，加入与消化液A等量的D/F12培养液终止消化，得到消化液B；将所述消化液B经离心、去上清液后，得到细胞沉淀物A；用D/F12培养液将所述细胞沉淀物A传入另一个培养瓶中，在37.5℃、含5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养3～6天，得到生长至80％～90％汇合的皮肤成纤维细胞；(4)细胞冻存：将所述步骤(3)所得的皮肤成纤维细胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混匀，先在4℃保存半小时，然后在-70℃冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存皮肤成纤维细胞；(5)细胞复苏：将所述步骤(4)所得的冻存皮肤成纤维细胞放入37℃水浴中融化，吸出细胞悬液，用9倍所述细胞悬液体积的D/F12培养液进行洗涤，经离心、去上清后，得到细胞沉淀物B；用D/F12培养液充分悬浮细胞沉淀物B，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二氧化碳培养箱中培养即可。