[发明专利]鲤鱼背肌中组织蛋白酶L的分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种组织蛋白酶L的分离纯化方法。本发明的组织蛋白酶L粗酶液先通过热处理游离出该酶，同时消除其他热不稳定性酶的影响，通过离心获得粗酶。随后经过疏水性凝胶层析，再经离子交换柱层析去除与组织蛋白酶L性质相近的其他组织蛋白酶如B、H、S型等，收集有酶活性的组分后通过70％硫酸铵沉淀。沉淀经缓冲液复溶，此过程同时可将组织蛋白酶L从其与其天然抑制剂形成的复合体中解离，经超滤净化去除低分子量的酶抑制剂并浓缩目标酶。浓缩液经体积排阻高效液相分离后获得组织蛋白酶L。本发明获得的CL不但纯度高而且活力保持亦较好。

主权项

鲤鱼背肌中组织蛋白酶L的分离纯化方法，其特征在于该方法包括如下步骤：步骤(1)取鲤鱼背肌白肉a克，加入b毫升的20毫摩尔/升Tris-盐酸缓冲液匀浆，在离心机转子温度为3～5℃、6000×g～6500×g条件下离心15～20min，得到上清液；所述的Tris-盐酸缓冲液pH为6.8～7.5，a∶b＝1∶5～10；步骤(2)将上清液在55～65℃条件下加热3～5min，置于冰水冷却，在离心机转子温度为3～5℃、8000×g～8500×g条件下离心15～20min，获得粗酶液；步骤(3)将得到的粗酶液经过疏水性凝胶层析，收集具有活性的组分并合并；所述的活性的组分由组织蛋白酶L专一性底物活性测定方法得到；步骤(4)将合并后的活性的组分经过离子交换层析，再次收集具有活性的组分并合并；步骤(5)加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到70％，离心获得沉淀；步骤(6)在得到的沉淀中加入的MacIlvaine缓冲液复溶，得到高浓度的部分纯化酶液；所述的MacIlvaine缓冲液pH为2.5～3.5；步骤(7)将高浓度的部分纯化酶液进行超滤浓缩，去除比组织蛋白酶L分子量低的蛋白质；步骤(8)进行体积排阻高效液相分离，最终获得纯化后的组织蛋白酶L。