[发明专利]腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法

摘要

一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，由构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体、引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体、构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体、构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体、标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化组成。本发明采用一种新的标记腺病毒核心蛋白的方法，该方法实现了对腺病毒核心蛋白真正意义的遗传水平上的荧光标记，这种标记方法删除了腺病毒基因组中的原有的核心蛋白基因，因此采用本发明的方法标记腺病毒核心蛋白，可以获得的100％被荧光蛋白标记的病毒颗粒。

主权项

一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于它是由下述步骤组成：(1)构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体采用酶切连接的方式将合成的DNA片段连入pUC19质粒载体，获得的阳性克隆命名为pUC19M，采用聚合酶链式反应扩增核心蛋白DNA序列上下游序列，将获得的核心蛋白上下游DNA片段连入pUC19M载体；将含有一个酶切位点的筛选基因连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，获得向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体；(2)引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体将步骤(1)中获得的腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体经双酶切回收后与重组腺病毒载体质粒共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体；(3)构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体采用聚合酶链式反应获得标记基因的DNA序列，将标记基因序列连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，经过鉴定获得标记基因标记核心蛋白的穿梭载体；(4)构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体将步骤(3)中获得的标记基因标记核心蛋白的穿梭载体经双酶切回收后与经过线性化的引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得标记基因标记核心蛋白的腺病毒质粒载体；(5)标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化将线性化的标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体转染HEK293细胞，扩增、分离、纯化，得到标记基因标记核心蛋白的腺病毒，在冰箱内‑80℃保存。