[发明专利]牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法

摘要

牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法，它涉及细胞的体外分离培养及诱导分化的方法。它解决了现有牛肌卫星细胞的分离培养存在成本高，传代稳定性不好，且诱导分化存在所获肌管数量少及不具有收缩功能的问题。方法：清洗组织，用胰蛋白酶和胶原酶液消化；过滤后离心，重悬细胞，接种后用差速贴壁法培养细胞；培养至汇合率为95%，用胰酶进行传代即完成。方法：获得PEI-质粒复合物；牛肌卫星细胞培养至汇合率为75%，清洗后加DMEM高糖培养液，将PEI-质粒复合物加到细胞表面，更换培养液A培养，再更换培养B诱导分化即完成。本发明牛肌卫星细胞的分离培养成本低，传代稳定性好，诱导分化所获肌管数量大且具有收缩功能。

主权项

牛肌卫星细胞的体外分离培养方法，其特征在于牛肌卫星细胞的体外分离培养方法按以下步骤实现：一、用D-Hanks液清洗牛肌肉组织并剪成1mm3的小块，然后置于含有0.25g胰酶的D-Hanks液中，在37℃下消化30min，再离心弃去上清，然后加入胶原酶液，在37℃下消化2～3h，得细胞悬液；二、采用400目孔径的筛网过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用D-Hanks液重悬并离心，再用细胞生长培养液重悬细胞，然后接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中，采用差速贴壁法培养细胞ppl至pp6；三、将pp6中的细胞培养至汇合率为95%，然后采用质量浓度为0.25%的胰酶进行传代，即完成牛肌卫星细胞的体外分离培养；其中步骤一中D-Hanks液由8g的NaCl、0.6g的Na2HPO4.2H2O、4g的KCl、0.6g的KH2PO4、3.5g的NaHCO3、5g的青链霉素、1.0g的两性霉素B和1000mL三蒸水组成；步骤一中胶原酶液由0.2g的胶原酶Ⅰ、100ml的DMEM高糖培养液和1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成；步骤二中细胞生长培养液由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的马血清、1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成，pH值为7.2；步骤三中传代的比例为1∶1。