[发明专利]禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因型的分型检测方法

摘要

本发明属于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)多菌灵抗性基因型的分子检测和SNP分型方法，可用于引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂抗药性监测及抗药性基因型诊断。该检测方法共分3个主要步骤，(1)提取待测菌株的核基因组DNA；(2)运用三组引物对，进行PCR反应；(3)根据PCR产物电泳图谱鉴定菌株对多菌灵抗性的基因型。采用Tetra-primer ARMS PCR(Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR)技术可以快速、准确地检测出禾谷镰孢菌抗药性菌株及其基因型，并以此判断抗药性水平。检测准确率达95％以上。

主权项

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)多菌灵抗性菌株基因型的分子检测和分型方法，其特征在于采用Tetra‑primer ARMS PCR(Tetra‑primer Amplification Refractory Mutation System‑PCR)技术快速、准确地检测出田间具有多菌灵抗性基因的抗药性禾谷镰孢菌菌株，并对抗药性基因进行SNP分型。禾谷镰孢菌具有抗多菌灵基因的菌株检测方法，共分三步：第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测样品的核基因组DNA。第二步：运用三组引物对，进行PCR反应，获得三组PCR产物。PCR反应体系及扩增程序：(1)氨基酸167位扩增：反应体系：PCR buffer(10×)            2.5μLdNTP(2.5mM each)            2μLMgCl2(25mM)                 1.5μLF‑out167/R‑out167(10μM)    各0.2μlF‑in167T(10μM)             0.5μLR‑in167A(10μM)             0.8μldH2O(灭菌蒸馏水)            15.1μLTaq(5U/μL)                 0.2μLDNA模板                     2.0μL                                  总体积                      25μL扩增条件：预变性：94℃    5min          ↓变性：94℃      15s退火：66℃      30s延伸：72℃      30s35个循环          ↓延伸：72℃      5min(2)氨基酸198位扩增：反应体系：PCR buffer(10×)        2.5μLdNTP(2.5mM each)            2μLMgCl2(25mM)                 1.5μLF‑out198/R‑out198(10μM)    各0.4μlF‑in198A(10μM)             0.15μLR‑in198G(10μM)             0.4μldH2O(灭菌蒸馏水)            15.45μLTaq(5U/μL)                 0.2μLDNA模板                     2.0μL                                 总体积                      25μL扩增条件：预变性：94℃    5min           ↓变性：94℃      15s退火：65℃      30s延伸：72℃      30s35个循环          ↓延伸：72℃     5min(3)氨基酸200位扩增：反应体系：PCR buffer(10×)           2.5μLdNTP(2.5mM each)           2μLMgCl2(25mM)                1.5μLF‑out200/R‑out200(10μM)   各0.8μlF‑in200T(10μM)            0.5μLR‑in200A(10μM)            0.5μldH2O(灭菌蒸馏水)           14.2μLTaq(5U/μL)                0.2μLDNA模板                    2.0μL                                     总体积                     25μL扩增条件：预变性：94℃    5min          ↓变性：94℃      15s退火：55℃    30s延伸：72℃    30s35个循环        ↓延伸：72℃    5min第三步：将获得的PCR产物电泳，根据电泳图谱可以准确鉴定菌株基因型，并以此判断菌株抗药性水平。